嬰幼兒奶粉和米粉中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及其毒素基因檢測

張 靜，于三科，王 新*，喬明宇，周 婷，夏效東，楊保偉，席美麗，孟江洪

(1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100)

嬰幼兒奶粉和米粉中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及其毒素基因檢測

張 靜1,2，于三科2，王 新1,*，喬明宇1，周 婷2，夏效東1，楊保偉1，席美麗1，孟江洪1

(1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100)

目的：了解嬰幼兒奶粉和米粉中金黃色葡萄球菌的污染及其毒素基因的攜帶情況。方法：采集陜西省18個地區不同品牌的嬰幼兒奶粉143份和米粉224份，按國標法和PCR方法進行金黃色葡萄球菌分離鑒定；采用PCR方法檢測ses基因、ets基因、tsst-1基因和pvl基因。結果：367份樣品中檢測出30個金黃色葡萄球菌污染樣品，檢出率為8.17%，其中奶粉11.19%(16/143)、米粉6.25%(14/224)，分別從中分離鑒定出29株和25株金黃色葡萄球菌；從54株金黃色葡萄球菌中共檢測到有64.8%(35/54)的菌株攜帶有毒素基因，其中奶粉72.4%(21/29)、米粉56.0%(14/25)；奶粉分離株中檢測到的毒素基因型有pvl、sea、seb、sed、seg、sea＋pvl、seb＋seg、seb＋sed＋seg、sec＋pvl、sec＋seg＋pvl和seg＋pvl，其檢出率分別為10.3%(3/29)、3.4%(1/29)、3.4%(1/29)、3.4%(1/29)、6.9%(2/29)、6.9%(2/29)、6.9%(2/29)、3.4%(1/29)、3.4%(1/29)、13.8%(4/29)和 10.3%(3/29)；米粉分離株中檢測到的毒素基因型有pvl、sed、seg、sea＋seg＋pvl、sec＋pvl、sec＋seg、sec＋see＋seg、sec＋see＋seg＋pvl、see＋pvl和seg＋pvl，其檢出率分別為8%(2/25)、4%(1/25)、4%(1/25)、4%(1/25)、4%(1/25)、8%(2/25)、4%(1/25)、4%(1/25)、4%(1/25)和12%(3/25)。奶粉和米粉中都沒有檢測到ets、tsst-1和seh、sei、sej基因。結論：嬰幼兒奶粉和米粉中均存在一定程度的金黃色葡萄球菌的污染，且多數菌株都攜帶一定的毒素基因，這對消費這些產品的嬰幼兒身體健康構成潛在的危險。

奶粉；米粉；金黃色葡萄球菌；毒素基因

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S. aureus)是一種重要的食源性致病菌，在很多國家，它被認為是第二大食源性致病菌，僅次于沙門氏菌，占細菌性食物中毒的33%[1]；該菌在加拿大引起食物中毒的發生率更高，占45%[2]。金黃色葡萄球菌在自然界很常見，在土壤、空氣、動物及健康人群等均可存在。食品從農田到餐桌過程中均可能受到污染。嬰兒食品如奶粉、米粉等食品的加工過程雖受到嚴格的控制，但還是可能會受到不同程度的污染，這些被金黃色葡萄球菌污染的食物，可能會引起嬰兒對該菌的感染或食物中毒。

金黃色葡萄球菌產生多種外毒素，主要有腸毒素(staphylococcal enterotoxins，Ses)，剝脫毒素(exfoliative toxins，Ets)，中毒休克毒素-1(toxic-shock syndrome toxin-1，Tsst-1)和殺白細胞素(paton-valentine leukocidin，Pvl)等[3-7]。腸毒素是引起食物中毒的主要致病因子，除Sea、Seb、Sec和Sed這4種早已被鑒定的血清型外，近幾年還發現了See、Seg、Seh、Sei、Sej等新型腸毒素[8-10]。剝脫毒素大約5%的金黃色葡萄球菌產生，該毒素主要引起皮散熱功能失調，最嚴重的是引起金黃色葡萄球菌散熱性皮膚灼傷綜合癥，對嬰幼兒和兒童危害嚴重[11-12]。中毒休克毒素-1是中毒休克毒素中最重要的一種，它對女性危害嚴重，可產生高水平的抗體，從而引起局部或全身的中毒休克綜合癥[13]。大約5%的金黃色葡萄球菌存在殺白細胞素，該毒素可引起皮膚、軟組織感染和嚴重的壞死性肺炎[14]。

近年來，國內外對雞肉、豬肉、冰激凌、涼拌菜等各種食品中金黃色葡萄球菌污染狀況和毒素基因攜帶情況有較多的調查報道，但國內外對嬰幼兒奶粉和米粉中金黃色葡萄球菌的報道較少。奶粉和米粉已成為嬰幼兒必備的輔助食物或主要食物，鑒于其原料的易污染性，嬰幼兒食品中可能存在被金黃色葡萄球菌污染。本研究采用國標培養法和PCR方法進行分離鑒定S. aureus及其毒素基因檢測，初步了解嬰幼兒奶粉和米粉中S.aureus的流行狀況及毒素基因分布情況，為嬰幼兒食品的安全評估提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 培養基和主要試劑

緩沖蛋白胨水(BPW)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、Barid-Parker培養基(BP)、LB營養瓊脂 北京陸橋技術有限責任公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、2000bp DNA marker、引物 大連寶生物公司；瓊脂糖(agarose)美國Sigma公司；甘油、氯化鈉 西安化學試劑廠。

1.2 樣品采集及S. aureus分離

2010年7、8月采集陜西省18個地區不同品牌的嬰幼兒奶粉和米粉樣品共計367份，其中奶粉143份、米粉224份。依據GB/T 4789.10—2008《金黃色葡萄球菌檢驗》方法，取25g奶粉或米粉樣品接種于225mL的BPW培養基中，37℃培養24h，取增菌培養液3mL接種于30mL 7.5% NaCl TSB肉湯中，37℃培養24h。用棉簽從增菌液中劃到Baird-Parker Agar平板中，37℃培養24h，每個可疑樣品挑取1～2個菌落，進行純化培養。nuc基因的PCR反應條件，參照文獻[12]執行，最后取5μL PCR產物進行電泳檢測，進行S. aureus確證。

1.3 基因組 DNA的提取

用棉簽蘸取純培養細菌，置入裝有500μL蒸餾水的離心管中，混勻。加熱煮沸30min后，13000r/min離心5min，取上清液。于－30℃冰箱中保存備用。

1.4 PCR擴增及引物設計

按照Brakstad等[15]的報道，執行nuc基因的引物合成和擴增條件，以確定金黃色葡萄球菌。按照王琴等[16]報道執行pvl基因引物合成和擴增條件。按照Peles等[6]的報道執行ses和tsst-1引物合成和擴增條件。按照Noguchi等[17]的報道執行剝落毒素基因(eta、etb基因)引物合成和擴增條件。以上引物均由大連寶生物公司合成，引物序列及片段長度見表1。

1.5 電泳

PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠量為1%，利用標準大小的DNA Marker，觀察電泳完成后的凝膠，并記錄PCR擴增的結果。

2 結果與分析

2.1S. aureus分離鑒定

367份樣品中檢測出30個金黃色葡萄球菌污染樣品，檢出率為8.17%，其中奶粉143份當中有16份(11.19%)金黃色葡萄球菌陽性，并從中分離鑒定出29株金黃色葡萄球菌；米粉224份當中有14份(6.25%)金黃色葡萄球菌陽性，從中分離鑒定出25株金黃色葡萄球菌，結果如表2所示。

表1 PCR擴增引物Table 1 Oligonucleotide primers used in PCR

表2 嬰幼兒奶粉和米粉中金黃色葡萄球菌分離情況Table 2 Prevalence of S.aureus in infant milk powder and rice cereal

2.2 毒素基因的檢測

本研究對54株金黃色葡萄球菌菌株進行毒素基因檢測，結果如表3所示。共檢測到35株(64.8%)細菌攜帶有毒素基因，其中奶粉21株(72.4%)、米粉14株(56.0%)；pvl的檢出率為40.57%(22/54)，奶粉和米粉分離株的檢出率分別為44.83%(13/29)和36%(9/25)。奶粉分離株中攜帶的毒素基因型有pvl、sea、seb、sed、seg、sea＋pvl、seb＋seg、seb＋sed＋seg、sec＋pvl、sec＋seg＋pvl基因和seg＋pvl基因，其檢出率分別為10.3%(3/29)、3.4%(1/29)、3.4%(1/29)、3.4%(1/29)、6.9%(2/29)、6.9%(2/29)、6.9%(2/29)、3.4%(1/29)、3.4%(1/29)、13.8%(4/29)和10.3%(3/29)。奶粉分離株腸毒素基因攜帶率最高的是seg基因占41.4%(12/29)；米粉分離株中攜帶的毒素基因型分別為p v l、s e d、seg、se a＋se g＋pv l、sec＋pv l、se c＋se g、sec＋see＋seg、sec＋see＋seg＋pvl、see＋pvl基因和seg＋pvl基因，檢出率分別為8%(2/25)、4%(1/25)、4%(1/25)、4%(1/25)、4%(1/25)、8%(2/25)、4%(1/25)、4%(1/25)、4%(1/25)和 12%(3/25)；米粉分離株腸毒素基因攜帶率最高的是seg基因，占41.4%(12/29)。奶粉和米粉中都沒有檢測到ets、tsst-1、seh、sei基因和sej基因。

表3 54株金黃色葡萄球菌ets、tsst-1、pvl和ses毒素基因檢測結果Table 3 PCR detection of ets, tsst-1,pvl and ses genes from 54 Staphylococcus aureus isolates

3 討 論

金黃色葡萄球菌是重點監測的人畜共患致病菌，原則上不允許在食品中檢出。但從本研究結果可以看出，嬰幼兒奶粉和米粉中均存在金黃色葡萄球菌的污染，污染率分別是11.19%和6.25%。與印伯星等[18]報道的從生牛奶中金黃色葡萄球菌的污染率為16.27%基本一致；而與雷云瑞等[19]報道食品中的金黃色葡萄球菌的污染率66.7%存在較大差異，這可能與采集的樣品種類、采樣地點及包裝方式等有關。此外，近年來，由于“劣質奶粉”事件的頻發，使政府加強了對嬰幼兒食品的監管，這可能也是此次檢出率較低的原因之一。

從表3可以看出，嬰幼兒奶粉和米粉中金黃色葡萄球菌攜帶毒素基因型存在的種類眾多，但兩者菌株所攜帶的毒素基因的類型不同，其中奶粉和米粉的毒素基因的陽性率分別為72.4%(21/29)和56%(14/25)，表示同一地區不同食品中可能污染的來源及途徑可能不同，流行株也有可能不同，因此，毒素基因的檢出率和菌株攜帶毒素基因的類型也不同。pvl的檢出率為40.57%(22/54)，奶粉和米粉分離株的檢出率分別為44.83%(13/29)和36%(9/25)，這都與Gillet等[14]報道的檢出率小于4.5%有較大差異，說明不同國家和地區pvl的檢出率不同，提示食品中pvl毒素基因的流行可能具有地域性，也說明了陜西省市售嬰幼兒奶粉和米粉中S. aureus菌株攜帶pvl毒素基因較高，應加強該毒素的檢測。

章樂怡等[8]通過用PCR法測定食物中毒及食品中金黃色葡萄球菌的腸毒素基因(sea-sej)研究表明，腸毒素基因檢測率84.41%，其中在食品樣品分離株中，腸毒素基因攜帶率最高的是seh基因，而食物中毒標本分離株中，腸毒素基因攜帶率最高的是sea基因。李婉芬報道[9]生牛奶中金黃色葡萄球菌腸毒素基因(sea-seq)檢測率為56.36%，腸毒素基因攜帶率最高的是50.9%sej，其次為seg和sem，分別為23.63%和18.8%。本研究中腸毒素基因(sea-sej)的檢出率為55.6%(30/54)，其中在奶粉樣品分離株中，腸毒素基因攜帶率最高的是seg基因占41.4%(12/29)，而米粉分離株中腸毒素基因攜帶率最高的也是seg基因占36%(9/25)。這可能與菌株來源不同、不同食品加工處理過程中程序不同，以及操作人員的攜帶情況不同等有關，也進一步說明了不同地區，不同食品中金黃色葡萄球菌腸毒素基因流行情況不同。

本實驗通過PCR方法檢測到這些腸毒素基因的存在，可能存在這些腸毒素基因不表達[20]，但是現在腸毒素的檢測僅限制在傳統腸毒素Sea、Seb、Sec、Sed和See上，現在越來越多的報道證實除Sea-See以外的新型腸毒素也可以引起食物中毒[10]。而PCR方法不僅可以檢測傳統腸毒素基因還可以檢測許多新型腸毒素基因[8-10]，這樣可以快速檢測到這些腸毒素基因的存在，可以快速判定這些腸毒素可能存在，降低由金黃色葡萄球菌腸毒素引起食物中毒的風險。

有人認為傳統腸毒素Sea、Seb、Sec、Sed和See占金黃色葡萄球菌引起食物中毒的95%，而新型腸毒素僅占5%[8]。本次研究發現，新型腸毒素seg基因也廣泛存在于金黃色葡萄球菌中，并且比較有趣的是在本次檢驗的樣品中新型腸毒素seg基因最多，占38.9%(21/54)。國內王贊信等[10]對一起食物中毒金黃色葡萄球菌腸毒素基因(sea-sej基因)進行檢測，僅檢測到了seg基因和sei基因，說明seg基因和sei基因的存在可能與中毒有關。在本研究中也檢測到了傳統腸毒素sea、seb、sed基因和see基因的存在，進一步說明陜西省市售嬰幼兒奶粉和米粉中存在一定的安全隱患。嬰幼兒作為一個特殊的抵抗力弱的群體，對于其食品的安全性，更應時刻引起注意。相關企業應嚴格按照國家有關的規定進行生產，確保嬰幼兒的身體健康提供良好的保證。同時相關部門也應加強監管的力度，確保嬰幼兒食品的安全。

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Isolation, Identification and Toxin Genes Detection ofStaphylococcus aureusStrains from Infant Milk Powder and Infant Rice Cereal

ZHANG Jing1,2，YU San-ke2，WANG Xin1,*，QIAO Ming-yu1，ZHOU Ting2，XIA Xiao-dong1，YANG Bao-wei1，XI Mei-li1， MENG Jiang-hong1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. College of Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Objective: To investigate the prevalence and toxin genes profile ofStaphylococcus aureusin infant milk powder and infant rice cereal marketed in Shaanxi province, China. Methods: Totally 367 various samples from 18 regions in Shaanxi province were tested by the national standard method to isolateStaphylococcus aureus; the nuc genes were examined to confirmStaphylococcus aureusstatus;Staphylococcus aureusenterotoxin genes, exfoliative toxins genes, toxic-shock syndrome toxin-1 gene and Panton-Valentine Leukocidin gene were detected by PCR. Results: Of 367 samples examined, 30 were positive forStaphylococcus aureus, result in a positive rate of 8.17% (30/367), including 11.19% (16/143) milk powder samples and 6.25%(14/224) rice cereal samples. From these positive samples, 29 and 25 strains were isolated from milk powder and rice cereal samples respectively. Among all identifiedStaphylococcus aureusisolates, 34 strains harbored at least one of the tested toxin genes.The toxins gene profiles detected inS. aureusfrom infant milk powder samples werepvl,sea,seb,sec,sed,seg,seb＋seg,sec＋segandseb＋sed＋seg, and their positive rates were 44.82% (13/29), 10.34% (3/29), 13.79% (4/29), 17.24% (5/29), 6.89% (2/29),41.38% (12/29), 10.34% (3/29), 10.34%(3/29) and 3.45% (1/29) respectively; The toxin gene profiles inS. aureusfrom infant rice cereal samples werepvl,sea,sec,sed,see,seg,sea＋seg,sec＋segandsec＋see＋seg, and the positive rates were36% (9/25), 4% (1/25), 20% (5/25), 4% (1/25), 12% (3/25), 36% (9/25), 4%(1/25), 16% (4/25) and 8% (2/25), respectively. Neitherets,tsst-1,seh,seinorsejgenes were detected in infant milk powder or infant rice cereal. Conclusion: Infant milk powder and infant rice cereal in Shaanxi province were contaminated withS. aureus, some of which contained various toxin genes. The existence of the pathogen in these food products may constitute a potential risk for infants,health.

infant milk powder；infant rice cereal；Staphylococcus aureus；toxins genes

2010-12-22

張靜(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為動物疾病防治。E-mail：0503108029@163.com

*通信作者：王新(1973—)，男，講師，博士，研究方向為食源性病原及分子生物學。E-mail：xinwang7516@yahoo.com.cn

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1002-6630(2011)20-0167-04