紅樹莓花色苷的提取及抗氧化活性研究

肖軍霞，黃國清,2，仇宏偉，王成榮,*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

紅樹莓花色苷的提取及抗氧化活性研究

肖軍霞1，黃國清1,2，仇宏偉1，王成榮1,*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

采用酸化乙醇法提取紅樹莓中的花色苷，通過正交試驗(yàn)確定花色苷提取的最佳條件，同時(shí)對(duì)紅樹莓花色苷提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，以鹽酸酸化的80%乙醇溶液(pH3)按1:20(g/mL)的料液比在60℃提取紅樹莓1.5h，此條件下，鮮果中花色苷提取量達(dá)0.625mg/g。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，紅樹莓花色苷提取物的還原能力、對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的抑制率均隨質(zhì)量濃度的升高而增加。紅樹莓花色苷提取物抑制羥自由基和超氧陰離子自由基的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為0.175mg/mL和0.699mg/mL，說明紅樹莓花色苷提取物抑制羥自由基比抑制超氧陰離子自由基的能力強(qiáng)。

紅樹莓；花色苷；提取；抗氧化

紅樹莓(Rubus idaeus)為薔薇科懸鉤子屬多年生落葉果樹，小灌木，俗稱“覆盆子”、“托盤”、“馬林”、“梅子”等[1]。紅樹莓營養(yǎng)豐富齊全，含有多種人體不可缺少且易吸收的營養(yǎng)元素，如VB2、鈣、鋅、鐵、鎂等，尤其是VC含量是蘋果的5倍[2-3]。此外，紅樹莓中含量豐富的花色苷，是其主要的呈色物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，紅樹莓花色苷具有抗氧化、抗突變、降低血清及肝臟中脂肪含量等功能[4-5]。

目前食品工業(yè)上所用的色素多為合成色素，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人類對(duì)健康的重視，人們對(duì)天然色素的需求量會(huì)越來越大。紅樹莓已被開發(fā)加工成多種營養(yǎng)美味的食品，但對(duì)其色素的提取及功能性研究較少。本實(shí)驗(yàn)研究了紅樹莓花色苷的提取條件和抗氧化活性，為開發(fā)功能性天然色素和綜合利用紅樹莓資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍紅樹莓由萊陽冷食廠提供，使用之前于室溫解凍。

95%乙醇、鹽酸、乙酸、30%雙氧水、三氯乙酸、抗壞血酸、2-硫代巴比妥酸、鐵氰化鉀、L-蛋氨酸、核黃素、脫氧核糖等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000紫外分光光度計(jì) 上海尤尼科儀器有限公司；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；CP-214奧豪斯電子分析天平 上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

紅樹莓→研磨→恒溫水浴提取→過濾→真空濃縮→冷凍干燥→紅樹莓花色苷提取物

1.3.2 花色苷含量的檢測(cè)方法

1.3.2.1 最大吸收波長的測(cè)定

將紅樹莓解凍，攪碎，準(zhǔn)確稱取5.0g紅樹莓勻漿，按1:10料液比加用鹽酸酸化的pH3 80%乙醇溶液置于50℃水浴鍋中浸提1h，浸提液經(jīng)過濾除去殘?jiān)脼V液。在400～700nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定花色苷的最大吸收波長。

1.3.2.2 測(cè)定方法

參考馮建光等[6]方法稍做改動(dòng)。準(zhǔn)確吸取上述濾液1mL與10mL pH1.0的鹽酸緩沖液混合，搖勻；再準(zhǔn)確吸取上述濾液1mL與10mL pH4.5醋酸緩沖液混合，搖勻。分別用pH1.0、pH4.5的緩沖液為空白對(duì)照，于最大吸收波長處測(cè)吸光度，按照公式計(jì)算花色苷提取量。

式中：X為紅樹莓花色苷含量/(mg/g)；ΔT為吸光度ApH1和ApH4.5的差值；V為稀釋體積/L；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(449g/mol)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)[29600L/(mol·cm)]；m為樣品質(zhì)量/g；b為比色皿厚度(1cm)。

1.3.3 紅樹莓花色苷提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對(duì)提取溶劑、料液比和浸提溫度等影響因素(具體的因素水平根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果而確定)進(jìn)行研究，提取1次，時(shí)間1.5h，以篩選最佳提取條件(表1)。

表1 正交試驗(yàn)條件因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.3.4 紅樹莓花色苷提取物抗氧化活性研究

1.3.4.1 待測(cè)溶液的配制

按最佳工藝條件提取紅樹莓花色苷，經(jīng)冷凍干燥得到紅樹莓花色苷提取物，用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度1mg/mL貯備液，4℃冰箱中保存待用。臨用前稀釋到所需質(zhì)量濃度。

1.3.4.2 還原能力的測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法測(cè)定[7-8]。取不同質(zhì)量濃度的紅樹莓花色苷提取物各1mL，分別加入0.2mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)、0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% K3[Fe(CN)6]于試管中，混勻在50℃水浴中反應(yīng)20min后，用流水速冷，再加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸混勻，以3000r/min離心10min后取1.5mL上清液，加0.2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% FeCl3和3mL蒸餾水搖勻，放置5min，以蒸餾水調(diào)零，測(cè)定A700。A700越大，表示還原能力越強(qiáng)。

1.3.4.3 對(duì)羥自由基(·OH)的抑制作用

采用D-脫氧核糖-鐵體系法測(cè)定[9-10]。依次加入0.4mL 50mmol/L pH7.5的磷酸緩沖液及1.04mmol/L EDTA、1.0mmol/L FeCl3、2.0mmol/L VC和10.0mmol/L H2O2各0.1mL，再分別加入不同質(zhì)量濃度的紅樹莓花色苷提取物0.1mL(對(duì)照管不加，補(bǔ)蒸餾水0.1mL)和0.1mL 60mmol/L脫氧核糖(試劑空白管不加，補(bǔ)蒸餾水0.1mL)，混勻。保證各管終體積為1.0mL，在37℃保溫1h后取出加入1.0mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%鹽酸終止反應(yīng)，然后加1.0mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%硫代巴比妥酸(TBA)，沸水浴反應(yīng)15min顯色，冷卻后于532nm波長處測(cè)定吸光度。計(jì)算樣品對(duì)基自由基的抑制率：

式中：A0為對(duì)照的吸光度；A1為加入清除劑后的吸光度；A2為試劑空白的吸光度。

1.3.4.4 對(duì)超氧陰離子自由基(O2－·)的抑制作用

采用核黃素-蛋氨酸光照法測(cè)定[11-12]。以pH7.8 0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液作溶劑，配制含1.3×10-2mol/L蛋氨酸、1.3×10-6mol/L核黃素、6.3×10-5mol/L氮藍(lán)四唑(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、1×10-4mol/L EDTA及不同質(zhì)量濃度的紅樹莓花色苷提取物，總體積為10mL。在25～30℃用功率為20W的熒光燈管照射20min后于560nm波長處測(cè)定吸光度。未加紅樹莓花色苷提取物的體系吸光度為A，加紅樹莓花色苷提取物后的吸光度為A1。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以x±s表示。采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析，并以LSD法進(jìn)行各組間的兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的測(cè)定

圖1 紅樹莓花色苷可見光掃描圖Fig.1 Visible scanning spectrum of red raspberry anthocyanin

由圖1可知，紅樹莓花色苷的最大吸收波長在510nm處，因此測(cè)定紅樹莓花色苷含量時(shí)都在此波長下進(jìn)行測(cè)定。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 紅樹莓花色苷提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of orthogonal array design

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis for orthogonal array design results

由表2中極差的相對(duì)大小得到影響紅樹莓花色苷提取的主次順序?yàn)榱弦罕龋窘釡囟龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)，最佳組合為A2B3C3。由表3方差分析可知，各因素對(duì)紅樹莓花色苷提取量的影響差異不顯著，綜合考慮紅樹莓花色苷提取效果，根據(jù)極差分析結(jié)果選取浸提紅樹莓花色苷的最佳條件為pH3、80%乙醇溶液按1:20(g/mL)的料液比在60℃提取紅樹莓漿1.5h，在此條件下，鮮果中花色苷提取量達(dá)0.625mg/g。

2.3 紅樹莓花色苷提取物抗氧化活性

2.3.1 還原能力

還原能力的大小可以反映抗氧化活性的大小[13]。由圖2可知，與0.031、0.063、0.125mg/mL紅樹莓花色苷提取物相比，0.25、0.5mg/mL的紅樹莓花色苷提取物的還原能力極顯著升高(P＜0.01)，但0.25mg/mL和0.5mg/mL的紅樹莓花色苷提取物的還原能力沒有顯著差異(P＞0.05)。紅樹莓花色苷提取物的還原能力在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)隨質(zhì)量濃度的增加而增大。

圖2 紅樹莓花色苷提取物的還原能力Fig.2 Reducing capacity of red raspberry anthocyanin extract

2.3.2 對(duì)·OH的抑制作用

羥自由基是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基，它可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷，使細(xì)胞壞死或突變[14]。由圖3可知，與0.031、0.063、0.125mg/mL紅樹莓花色苷提取物比較，0.25、0.5mg/mL紅樹莓花色苷提取物對(duì)·OH的抑制作用極顯著升高(P＜0.01)，但0.25mg/mL和0.5mg/mL的紅樹莓花色苷提取物對(duì)·OH的抑制作用沒有顯著差異(P＞0.05)。紅樹莓花色苷提取物在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)·OH均有抑制作用，并且隨質(zhì)量濃度增加其抑制率增強(qiáng)。紅樹莓花色苷提取物抑制·OH的半數(shù)有效濃度(EC50)為0.175mg/mL，說明紅樹莓花色苷富含供氫體，具有提供氫質(zhì)子的能力，可使具有高度氧化性的自由基還原，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，起到抑制自由基的目的。

圖3 紅樹莓花色苷提取物對(duì)羥自由基的抑制作用Fig.3 Scavenging capacity of red raspberry anthocyanin extract against hydroxyl radicals

超氧陰離子自由基的形成最早，是氧進(jìn)行單電子的還原反應(yīng)首先生成的產(chǎn)物。由它可生成羥自由基(·OH)、過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物(ROOH)及單線態(tài)氧等其他活性氧，引發(fā)人體許多疾病的生理變化過程。由圖4可知，與0.031、0.063mg/mL的紅樹莓花色苷提取物比較，其他質(zhì)量濃度的紅樹莓花色苷提取物對(duì)的抑制作用均呈極顯著升高(P＜0.01)，但0.25mg/mL和0.5mg/mL的紅樹莓花色苷提取物對(duì)的抑制作用沒有顯著差異(P＞0.05)。紅樹莓花色苷提取物在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，對(duì)·均有抑制作用，且隨質(zhì)量濃度的增加其抑制率增強(qiáng)。紅樹莓花色苷提取物抑制·的半數(shù)有效濃度(EC50)為 0.699mg/mL。

圖4 紅樹莓花色苷提取物對(duì)超氧陰離子自由基抑制作用Fig.4 Scavenging capacity of red raspberry anthocyanin extract against uperoxide anion radicals

自由基是在機(jī)體氧化反應(yīng)中自然產(chǎn)生的強(qiáng)氧化性化合物，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，引起慢性疾病及衰老效應(yīng)，而抗氧化劑是一類能夠阻斷自由基產(chǎn)生和清除自由基的物質(zhì)。適量補(bǔ)充外源性抗氧化劑來提高機(jī)體對(duì)自由基的清除能力，使機(jī)體內(nèi)自由基產(chǎn)生與清除保持平衡，對(duì)于延緩人體衰老和預(yù)防各種老年性疾病具有重要意義[15]。紅樹莓花色苷提取物抑制·OH和O2－·的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為0.175mg/mL和0.699mg/mL，說明紅樹莓花色苷提取物抑制·OH比抑制O2－·的能力強(qiáng)，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道結(jié)果不一致。這可能是與采用的紅樹莓花色苷提取方法不同有關(guān)，所得到的紅樹莓花色苷成分不同，導(dǎo)致最終抗氧化能力不同。

3 結(jié) 論

以pH3 80%乙醇溶液按1:20(g/mL)的料液比在60℃提取紅樹莓漿1.5h，此條件下，鮮果中花色苷提取量為0.625mg/g。紅樹莓花色苷在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，還原能力、對(duì)·OH和O2－·的清除率都隨著質(zhì)量濃度的升高而增加，其中0.5mg/mL的紅樹莓花色苷提取物對(duì)·OH的抑制率達(dá)87.32%，1mg/mL的紅樹莓花色苷提取物對(duì)O2－·抑制率達(dá)60.82%。紅樹莓花色苷提取物抑制·OH和O2－·的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為0.175mg/mL和0.699mg/mL，說明紅樹莓花色苷提取物抑制·OH比抑制 O2－·的能力強(qiáng)。

本研究表明，紅樹莓花色苷提取物具有較強(qiáng)的還原能力，對(duì)·OH和O2－·均具有較強(qiáng)抑制作用，在相同質(zhì)量濃度時(shí)，紅樹莓花色苷提取物對(duì)·OH比O2－·的抑制作用強(qiáng)。研究結(jié)果顯示紅樹莓花色苷具有直接清除自由基活性，是一種值得開發(fā)的具有較強(qiáng)抗氧化作用的天然色素。

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Extraction and Antioxidant Activity of Anthocyanins from Red Raspberry

XIAO Jun-xia1，HUANG Guo-qing1,2，QIU Hong-wei1，WANG Cheng-rong1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Acidified ethanol method was applied to extract anthocyanins from red raspberry (Rubus idaeus), and the optimal extraction conditions were determined by orthogonal array design. Treatment at 60 ℃ for 1.5 h using 20-fold volume of 80%ethanol aqueous solution containing hydrochloric acid (pH 3) as extraction solvent provided optimum extraction of anthocyanins,and an anthocyanin yield of 0.625 mg/g was achieved. In addition, the resulting extract was evaluated for its antioxidant activity.It was found that the extract displayed dose-dependent reducing power and abilities to scavenge hydroxyl and superoxide anion free radicals in the concentration range investigated here, and that the half-maximal effective concentrations (EC50) against hydroxyl and superoxide anion free radicals were 0.175 mg/mL and 0.699 mg/mL, respectively, indicating that the extract has stronger ability to scavenge hydroxyl free radicals than to scavenge superoxide anion free radicals.

red raspberry；anthocyanins；extraction；antioxidation

TS201.2

A

1002-6630(2011)08-0015-04

2010-07-19

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2006BAD22B07)；農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目(2006-G27-7)；校高層次人才啟動(dòng)基金項(xiàng)目(630630)

肖軍霞(1977—)，女，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)與微囊化研究。E-mail：achievexiao@163.com

*通信作者：王成榮(1958—)，男，教授，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏研究。E-mail：qauwcr@126.com