壇紫菜R-藻紅蛋白的穩定性研究

劉書來，鄭蔚然，丁玉庭

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江杭州310014)

壇紫菜R-藻紅蛋白的穩定性研究

劉書來，鄭蔚然，丁玉庭*

(浙江工業大學生物與環境工程學院，浙江杭州310014)

為了揭示壇紫菜R－藻紅蛋白(R－PR)的環境穩定性變化規律，分別研究了不同光照強度、溫度、pH和金屬離子條件下壇紫菜R－藻紅蛋白光譜特性的影響。研究結果表明:壇紫菜R－藻紅蛋白在40℃以下、弱光(2000lux以內)及pH5.0～8.0條件下相對穩定，光譜特性基本無變化;其中4℃、pH7.0的避光條件下R－PE尤為穩定;高溫、紫外線、酸堿環境均影響壇紫菜R－PE穩定性，導致在565nm和498nm處特征吸收峰發生顯著減弱并逐漸消失。壇紫菜R－藻紅蛋白的兩種藻膽色素的熱穩定性關系為:藻尿膽素＞藻紅膽素。此外，Fe2+、Fe3+、Cu2+對壇紫菜R－PE的穩定性的破壞作用顯著，而Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對其穩定性影響較小。

R－藻紅蛋白，穩定性，壇紫菜，光譜特性

藻紅蛋白(R－phycoerythrin，R－PE)具有色澤鮮艷和強熒光的特性，能夠取代合成色素廣泛應用于食品和化妝品，因此具有良好的市場前景［1］。由于R－PE易受溫度、光照和酸堿度等環境因素影響，極大地限制了其開發利用;目前已有學者進行了紅毛藻 R－PE［2］、紫球藻 B－PE［3］、螺旋藻 C－PC(藻藍蛋白，phycocyanin)［4］等藻膽蛋白的研究，但對壇紫菜R－PE的研究較少。我國壇紫菜資源十分豐富，可大量用于R－PE制備原料。本研究將利用壇紫菜提取制備R－PE，以A565和A498吸收光譜表征指標考察溫度、光照、pH和金屬離子對壇紫菜R－PE吸收光譜特性的影響，同時對其變性機理進行討論，為壇紫菜藻紅蛋白的提取分離、貯藏、開發利用提供很好的理論和應用指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

壇紫菜(Porphyra haitanensis) 采集于溫州洞頭，經蒸餾水浸泡清洗三次，冷凍干燥，并在冷卻條件下粉碎成60目于－20℃避光保存。

Alpha2－4 LD plus冷凍干燥機 德國CHRIST公司;CR21GⅡ高速冷凍離心機日本HITACH公司;UV－2450紫外－可見分光光度計日本SHIMADU公司;pHS－3C精密pH計 上海雷磁分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 壇紫菜R－PE的分離純化 稱取壇紫菜干粉以1∶20(w/v)懸浮于 0.01mol/L K2HPO4－KH2PO4緩沖液(pH7.0)，在－20℃與4℃溫度下反復凍融三次，離心(10000×g，4℃)20min，收集上清液。在該上清液中加入(NH4)2SO4進行分步鹽析，得到的紫紅色沉淀即為藻紅蛋白(R－PE)。將沉淀的R－PE重新溶于適量的上述磷酸鹽緩沖溶液中，并置于該緩沖液中透析24h(每隔 4h更換一次緩沖液)，離心(10000×g，4℃)10min。將離心后的上清液上樣倒羥基磷灰石柱，用0.01～0.10mol/L磷酸鉀緩沖液(含0.10mol/L NaCl，pH7.0)進行梯度洗脫，通過測定各管洗脫液吸收光譜的變化鑒別其R－PE的純度。收集含R－PE的洗脫液經超濾脫鹽后，再上樣到DEAE Sepharose F.F.層析柱，以 0.1～0.4mol/L NaCl溶液(pH7.0，含0.01mol/L磷酸鉀緩沖液)洗脫，對洗脫液進行光譜掃描，鑒定其R－PE純度較高的部分，脫鹽，凍干保存備用。

1.2.2 壇紫菜R－PE熱穩定性的研究 用0.01mol/L K2HPO4－KH2PO4緩沖液(pH7.0)稀釋同一濃度(A565為0.2～0.8)R－PE 溶液，分別在 4、28、40、50、70、80℃下避光恒溫放置1h后進行測定。

1.2.3 壇紫菜R－PE光穩定性的研究 用上述磷酸鹽緩沖液稀釋的同一濃度(A565為0.2～0.8)R－PE溶液，分別置于避光環境、陽光照射(均105lux)、室內自然光(均800lux)、日光燈光(均2000lux)及15W紫外燈光下5h后進行測定。

1.2.4 壇紫菜R－PE pH穩定性的研究 分別用檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0、4.0、5.0、6.0)、磷酸鈉緩沖液(pH7.0、8.0)、甘氨酸－NaOH 緩沖液(pH9.0、10.0)、碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖液(pH11.0)、氯化鉀－氫氧化鉀緩沖液(pH12.0)稀釋至A565為0.2～0.8的同一濃度R－PE溶液，4℃下避光放置0.5h后進行測定。

1.2.5 金屬離子對壇紫菜R－PE影響的研究 在壇紫菜R－PE溶液中加入金屬鹽類并稀釋至A565為0.2～0.8的同一濃度，金屬離子終濃度分別為 2g/L CaCl2、0.6g/L MgCl2、12mg/L ZnSO4、30mg/L FeSO4、45mg/L FeCl3、1mg/L CuSO4、0.50mg/L MnCl2，于 4℃下避光放置1h后進行測定。

1.2.6 吸收光譜測定 將壇紫菜R－PE的待測樣品避光放置至室溫后，進行紫外－可見光吸收光譜測定，掃描范圍為250～700nm，中速掃描，間隔1.0nm，狹縫寬2.0nm，比較考察A565和A498。

2 結果與討論

2.1 壇紫菜R－PE的吸收光譜特性

以砂為骨料、石膏為主要的膠結材料，水泥為輔助膠結材料，1%硼砂溶液作為緩凝劑。按照一定的配比號 573 進行試驗，配比情況為膠結材料與砂的比為5∶1，水泥、石膏比為7∶3。在本試驗中，取骨料的質量為1 700 g，按照相似材料配比方案計算，需要水泥 238 g，石膏 102 g，硼砂溶液 340 g。

壇紫菜R－PE溶液呈粉紅色且帶有熒光，其吸收光譜如圖1所示。圖譜顯示，壇紫菜R－PE在565nm和498nm處出現最大吸收峰，分別為其色基的特征吸收:藻紅膽素(phycoerythrobilin，PEB，λmax=565nm)和藻尿膽素(phycourobilin，PUB，λmax=498nm);540nm處有一吸收肩峰，應為雙峰型R－PE，與文獻報道相一致［5］。

溶液中的R－PE含量可用A565表示，且其純度通常以 A565/A280表示［1，6］。本研究中分離純化得到的壇紫菜R－PE，其濃度為0.6g/L，純度為1.2，已遠遠超過食品級要求，因此有望作為天然著色劑應用于食品中。

2.2 壇紫菜R－PE的熱穩定性

由圖2可知，40℃以下，壇紫菜R－PE吸收光譜特性和吸光值的變化不明顯;50～70℃，壇紫菜R－PE在565nm處的特征吸收峰下降變化明顯，而498nm處的特征吸收相對穩定，由此表明藻膽色素的熱穩定性PUB＞PEB;80℃以上時，壇紫菜R－PE的A565和A498由初始狀態時的0.637、0.395分別下降至0.261和0.339，且特征吸收峰消失。

圖1 壇紫菜R－PE的紫外可見吸收光譜

此外，近紫外區的吸收強度A隨著溫度升高而增大，這是因為藻膽蛋白變性使其色基外展于大環螺旋結構時，增大了其在近紫外段的吸光值。

色素蛋白的變性引起結構解離變化將直接影響吸收光譜特性及吸光值。通常用AVIS/AUV的大小表示藻膽蛋白色基構象的變化，天然態時AVIS/AUV＞4，變性時比值小于 1［7－8］。本研究結果表明:隨著溫度的升高，壇紫菜R－PE吸收光譜特性及吸光值存在明顯的差異性，甚至導致特征吸收峰逐漸衰弱并消失，這可能是其分子內部或分子間，由于熱能破壞了維護色基的藻紅膽素和藻尿膽素與亞基結合的鍵能的穩定結構所致［3］。

圖2 溫度對壇紫菜R－PE光譜特性的影響

2.3 壇紫菜R－PE的光穩定性

光照對壇紫菜R－PE穩定性的影響如圖3所示。結果表明，在避光、室內自然光和日光燈下，壇紫菜R－PE的吸收光譜特征和吸光值的變化不明顯;而紫外光和太陽光對壇紫菜R－PE穩定性影響顯著，565nm和498nm特征吸收強度均發生顯著下降，特別是紫外光照射后的A565值下降了71.73%，A498值下降了57.55%，這可能是紫外光引起壇紫菜R－PE的色基PEB和PUB降解或構象破壞使其摩爾吸光系數發生變化所致［2－3］。

圖3 光對壇紫菜R－PE光譜特性的影響

2.4 壇紫菜R－PE的pH穩定性

由圖4可知，壇紫菜R－PE在pH5.0～8.0內較穩定，其吸收光譜特征和吸光值差異不明顯，尤以pH7.0時最穩定;同樣PEB較穩定的pH為5.0～8.0，PUB為pH5.0～9.0。而在pH3.0和4.0時，R－PE溶液變成淺紫色，并產生紫色沉淀，其A565值分別下降了50.35%和23.85%，A498值則分別下降了38.28%和26.56%;當pH＞9.0時，R－PE溶液變成橙色，pH為11.0時，溶液顏色褪色、熒光淬滅，pH為12.0后，溶液幾乎完全褪色，A565值和A498值均顯著下降，分別由0.717和0.418下降至0.104和0.198，同時特征吸收峰消失，且產生一定紅移。壇紫菜R－PE在酸性環境內容易產生沉淀，這可能是該環境較接近其等電點所致;而在堿性環境內吸光度大幅度下降，可能是其結構易發生解離所致。

圖4 pH對壇紫菜R－PE光譜特性的影響

2.5 金屬離子對R－PE光譜特性的影響

Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+等金屬離子對壇紫菜R－PE的影響如圖5所示。結果表明，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對壇紫菜 R－PE 穩定性的影響不顯著，565nm和498nm時的特征吸收峰變化也不明顯。而Cu2+、Fe2+對藻膽色素在近紫外區的影響較大，壇紫菜R－PE溶液中加入Fe3+后即刻產生紫紅色絮狀沉淀析出而逐漸變成無色;加入Cu2+后即刻成為紫色渾濁液。同時從Cu2+影響的光譜中發現，PEB的吸收峰下降明顯，而PUB的吸收峰變化不明顯。這可能是其引起R－PE結構變化導致摩爾吸光系數的改變。Fe2+和Fe3+差異性之大有待進一步研究。

圖5 金屬離子對壇紫菜R－PE光譜特性的影響

3 結論

壇紫菜 R－PE適宜在 40℃以下、可見光強2000lux以內及 pH5.0～8.0條件下加工;其中4℃、pH7.0的避光條件為保存壇紫菜R－藻紅蛋白的最佳條件;不宜添加 Fe2+、Fe3+、Cu2+等營養強化劑，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+對其穩定性影響較小。兩種藻膽色素的熱穩定性關系為:藻尿膽素＞藻紅膽素。本研究結果可以為壇紫菜R－PE作為食品添加劑的應用提供理論依據。

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Study on the stability of R－phycoerythrin from Porphyra haitanensis

LIU Shu－lai，ZHENG Wei－ran，DING Yu－ting*

(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang of University Technology，Hangzhou 310014，China)

Effects of environmental factors such as heat，light，pH and some metal ions of nutrition fortifiers on specific absorption spectrum characteristics of R－phycoerythrin(R－PE)from Porphyra haitanensis were systematically investigated in this paper.The specific absorption spectrum of R－PE was relatively stable when it was stored at 4～0℃，pH5.0～8.0 and faint light(below 2000 lux).The optimum storage conditions for R－PE was 4℃，pH7.0 and in completely dark.High temperature，extreme pH and ultraviolet ray greatly affected the specific absorption spectrum of R－PE and led to declining of the specific absorption peaks or even disappearance.Thermo stability of R－PE was as follows:PUB ＞PEB.The addition of Fe2+，Fe3+and Cu2+had significantly denatured effects on R－PE，while Ca2+，Mg2+，Zn2+and Mn2+had no apparent effect on the specific absorption spectrum of R－PE.

R－phycoerythrin;stability;Porphyra haitanensis;specific absorption spectrum

TS255.1

A

1002－0306(2011)09－0120－03

2010－09－01 *通訊聯系人

劉書來(1977－)，男，博士，副教授，研究方向:海洋資源開發與利用。

國家“863”高技術研究發展計劃資助項目(2007AA091801)。