3，4，5-三羥基苯甲酸印跡聚合物的分子識別特性

張鐵莉

（唐山師范學院 化學系，河北 唐山 063000）

分子印跡聚合物（MIP）對目標分子具有高度的選擇性，具有仿生抗體之美喻，是用化學方法合成的大分子受體[1]，在固相萃取、傳感器、催化反應等領域已展現了廣泛的應用前景[2-4]。目前，盡管采用非共價印跡技術已經成功制備了多種化合物的印跡聚合物，但是制備出高分子識別能力的MIP并非易事。為了更好地闡明分子印跡及識別機理，研究模板分子的結構對 MIP分子識別性質的影響，對于高親和力和高選擇性 MIP的制備具有重要的理論指導意義。本課題組[5]曾制備了羥基數目及位置不同的羥基苯甲酸化合物的印跡聚合物，研究了模板分子中作用基團的數目及位置對非共價 MIP印跡效應的影響。本文對其中印跡效果最好的3，4，5-三羥基苯甲酸（3，4，5-THBA）印跡聚合物進行了Scatchard分析，得到了其結合特性參數。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Shimadzu UV-265紫外可見分光光度計（日本島津公司），1cm石英吸收池；HY-2A調速多用振蕩器（江蘇常州國華儀器廠）；其他同文獻[5]。

1.2 聚合物的合成

將 1mmol(188 mg) 3，4，5-THBA（含一個分子結晶水，模板）、6mmol（427 mg）丙烯酰胺（功能單體）、30mmol （5.7 mL）乙二醇二甲基丙烯酸酯（交聯劑）和30mg偶氮二異丁腈（引發劑）加入到180×18mm硬質玻璃試管中，溶于10mL乙腈（MeCN），通 N210min，液氮條件下真空封管，60°C水浴中反應24h。將所得聚合物破碎、研磨、過篩，用丙酮反復沉降聚合物顆粒，傾瀉法除去過細的粉末，得到粒徑小于 30μm 的印跡聚合物 P(3，4，5-THBA)顆粒。60°C 真空干燥，放入保干器中備用。空白聚合物BP的制備除不加模板外，制備和處理步驟同上。

1.3 色譜法評價聚合物的分子識別性能

按照文獻[5]方法，測定各實驗化合物BA（Benzoic acid）、SA（Salicylic acid）、3-HBA（3-Hydroxybenzoic）、4-HBA（4-Hydroxybenzoic acid）、2，4-DHBA（2，4-Dihydroxybenzoic acid）、3，4-DHBA（3，4-Dihydroxybenzoic acid）、GA（Gentisic acid）、3，4，5-DHBA（3，4，5-Trihydroxybenzoic acid）、CAT（Catechol）、RH（Rhein）的保留時間并計算容量因子k’。

1.4 Scatchard 方法研究 P(3，4，5-THBA)的結合特性

首先以HAc/CH3OH=2/8(V/V)溶液為洗脫液，用索氏提取法將聚合物中的模板以及未反應的功能單體、交聯劑等從P(3，4，5-THBA)中洗出（紫外監測），再用甲醇洗去聚合物中殘留的 HAc（紫外監測），然后在 60°C下真空干燥。稱取干燥的P(3，4，5-THBA)30mg，置于10mL具塞磨口錐形瓶中，加入3.0mL濃度c為0～2.5 mmol/L的3，4，5-THBA乙腈溶液，室溫振蕩10h，轉入5mL具塞離心試管中，以6000rpm轉速離心 10min。取適量離心液用乙腈稀釋至一定體積，在268nm波長下測定其吸光度，求出溶液中3，4，5-THBA的平衡濃度[3，4，5-THBA]。根據吸附前后溶液中 3，4，5-THBA 濃度的變化值，計算P(3，4，5-THBA)對3，4，5-THBA的吸附量Q。以Q對3，4，5-THBA的初始濃度c作圖，則得到吸附等溫線；以Q/[3，4，5-THBA]對Q作圖，則得到Scatchard圖，計算解離常數和結合位點數。

2 結果與討論

2.1 P(3，4，5-THBA)的分子識別性能

圖1為在不同H2O含量（1～3%H2O）的乙腈流動相中，采用色譜法測定得得 P(3，4，5-THBA)及 BP對各實驗化合物的保留值。由圖1可知：（1）在實驗的不同H2O含量的乙腈流動相中，3，4，5-THBA 在 P(3，4，5-THBA)上的保留值均顯著大于其在 BP上的保留值，說明 P(3，4，5-THBA)對3，4，5-THBA 具有顯著的印跡效應。（2）隨著流動相中 H2O含量的增大，3，4，5-THBA及其他各實驗化合物的k’均減小。這是由于 H2O有很強的氫鍵形成能力，能與實驗化合物競爭結合聚合物上的酰胺基團的緣故。這反映了在 P(3，4，5-THBA)的結合過程中，氫鍵結合起了十分重要的作用。

圖1 乙腈中水含量對P(3，4，5-THBA)和BP結合能力的影響

2.2 混合物的色譜分離

在印跡聚合物和空白聚合物上，模板化合物及其結構類似物混合物溶液分離的色譜圖，可以直觀地反映印跡聚合物分離能力的提高。圖 2是 3，4-二羥基苯甲酸（3，4-DHBA）和 3，4，5-THBA 混合物溶液在 P(3，4，5-THBA)和 BP 上分離的色譜圖。

圖 2 3，4-DHBA 和 3，4，5-THBA 在 BP 柱（A）和P (3，4，5-THBA)柱（B）上分離的色譜圖

流動相：H2O/MeCN =1.5/98.5（V/V）；流速：1.6 mL/min；檢測波長：260nm；組分濃度：0.5mmol/L；進樣體積：100μL

由圖 2可見，此二組分在 BP上只能部分分離，而在P(3，4，5-THBA)上二者幾乎達到了基線分離。這說明由于這兩種化合物在 BP上非特異性結合能力的差異，BP對其也有一定的分離能力；但由于 3，4，5-THBA 的印跡效應，P(3，4，5-THBA)對其有更好的分離能力。同時也可看到3，4-DHBA 和 3，4，5-THBA 在 P(3，4，5-THBA)上的色譜峰均顯著展寬并有拖尾，說明 P(3，4，5-THBA)上的結合位點是不均勻的。這一點在P(3，4，5-THBA)的結合特性研究中（2.3）得到了進一步證實。非共價印跡聚合物結合位點的多抗性是其用于色譜分離時，色譜柱柱效不高的重要原因，也是其用于HPLC時存在的主要問題。

2.3 Scatchard 方法研究 P(3，4，5-THBA)的結合特性

為了測定 P(3，4，5-THBA)對 3，4，5-THBA 的結合特性參數，在3，4，5-THBA的濃度為0～2.5mmol/L范圍內，用平衡結合法測定了 P(3，4，5-THBA)對 3，4，5-THBA 的結合等溫線（圖 3）。P(3，4，5-THBA)對 3，4，5-THBA 的結合量 Q 隨 3，4，5-THBA初始濃度的增大而增大，并且在實驗測定的濃度范圍內未達到飽和。這是由于聚合物中存在隨初始濃度線性增加的非特異性吸附作用，致使 P(3，4，5-THBA)的吸附等溫線很難達到飽和，這一結果與生物大分子受體類似，與文獻[6]報道的情況類似。

圖 3 3，4，5-THBA 在 P(3，4，5-THBA)上的吸附等溫線

根據 Scatchard 方程[6]，可以得到 P(3，4，5-THBA)的結合特性參數。Scatchard方程：

Q/[3，4，5-THBA]=(Qmax-Q)/KD

式中，Q 是 P(3，4，5-THBA)對 3，4，5-THBA 的結合量，Qmax是最大表觀結合位點數，KD是離解常數，[3，4，5-THBA]是3，4，5-THBA 的平衡濃度。在所研究的濃度范圍內，以Q/[3，4，5-THBA]對 Q 作圖，得到兩條直線（圖 4），其線性回歸方程分別為：

Q/[3，4，5-THBA]=125.3-4.098Q（R2=0.997）

Q/[3，4，5-THBA]=39.61-0.4339Q（R2=0.921）

圖 4 3，4，5-THBA 在 P(3，4，5-THBA)上的 Scatchard 圖

這表明 P(3，4，5-THBA)中存在兩類結合位點。由直線的斜率和截距可分別求得高、低親和力結合位點的離解常數和最大結合位點數。高親和力結合位點的離解常數 KD1=2.4×10-4mol/L，最大結合位點數Qmax1=30.6μmol/g；低親合力結合位點的離解常數 KD2=2.3×10-3mol/L，最大結合位點數 Qmax2=91.1μmol/g。

多數非共價分子印跡聚合物具有不均勻的結合位點[6]，主要影響因素有兩個[7]：（1）由于印跡聚合物的形態不規則，使得識別位點不一致，識別位點可能位于交聯密度及可接近性不同的聚合物鏈上，這與制備多克隆抗體類似；（2）由于在非共價分子印跡過程中，功能單體和模板分子的結合處于動態平衡，可導致產生不同結合能力的結合位點。

3 結論

以丙烯酰胺-乙二醇二甲基丙烯酸酯為基體的印跡聚合物 P(3，4，5-THBA)對 3，4，5-THBA 具有選擇性結合能力，氫鍵作用在其分子識別過程中起重要作用。Scatchard分析表明，P(3，4，5-THBA)對 3，4，5-THBA 存在兩類不同結合能力的結合位點，高親和力結合位點的離解常數KD1=2.4×10-4mol/L，最大結合位點數Qmax1=30.6μmol/g；低親合力結合位點的離解常數 KD2=2.3×10-3mol/L，最大結合位點數Qmax2=91.1μmol/g，其結合位點的不均勻性，是造成其色譜峰拖尾的原因。