超聲波輔助提取馬齒莧總生物堿的研究

徐 鶴，張海悅，*，蔡 苗

(1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012;

2.吉林省軍隊離退休干部療養(yǎng)中心，吉林長春 130061)

超聲波輔助提取馬齒莧總生物堿的研究

徐 鶴1，張海悅1，*，蔡 苗2

(1.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012;

2.吉林省軍隊離退休干部療養(yǎng)中心，吉林長春 130061)

研究了超聲波輔助提取馬齒莧生物堿的最佳工藝。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面研究乙醇濃度、料液比、超聲波作用時間和回流時間對生物堿得率的影響。經(jīng)過優(yōu)化后的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度為95%，料液比為1∶10(g/mL)，超聲波作用時間為15min，回流時間為1h。

馬齒莧，生物堿，超聲波提取，響應(yīng)面

馬齒莧(Port ulaca oleracea L.)，又名馬舌菜、長命菜等，為馬齒莧科植物全草，遍布全國，《本草圖經(jīng)》稱其為“五行草”。馬齒莧是我國87種藥食同源的野生植物之一，在民間應(yīng)用歷史悠久，它不僅有清熱、解毒、消炎、利尿等功效，而且含有豐富的營養(yǎng)成分［1］。馬齒莧中的有效成分如生物堿、多糖、黃酮、蒽醌等［2］，具有防治心血管疾病、降血脂、抗衰老等作用。近年來研究表明，馬齒莧不僅具有抗心血管疾病和抗氧化的功效，而且具有抗癌的作用，許多生物堿是抗癌的有效成分［3－5］。白冰［6］等人研究馬齒莧的活性成分對α－葡萄糖苷酶抑制作用，結(jié)果表明馬齒莧總堿的抑制率高達(dá)80%。目前，英國、法國與荷蘭已先后育成蔬菜專用馬齒莧優(yōu)良品種，美國已將馬齒莧作為保健食品廣為開發(fā)［7］。超聲波萃取中藥材活性成分的優(yōu)越性是基于超聲波的特殊物理性質(zhì)，與傳統(tǒng)提取工藝相比，超聲波萃取具有較為突出的特點。利用超聲波處理產(chǎn)生的乳化、擴散、擊碎、振蕩等多級效應(yīng)，加速活性成分的轉(zhuǎn)移、擴散，從而提高浸出效率及產(chǎn)品純度［8－9］。響應(yīng)曲面法是統(tǒng)計設(shè)計實驗技術(shù)的合成，已被廣泛地應(yīng)用在諸多工藝優(yōu)化控制領(lǐng)域。響應(yīng)曲面法可以幫助建立一個或多個測定指標(biāo)與關(guān)鍵影響因素之間的關(guān)系模型，并可以進行定量分析［10］。目前，對馬齒莧生物堿的研究報道較少，為此該文以馬齒莧為原料，研究馬齒莧生物堿提取效果的影響因素，從而確定了馬齒莧總生物堿提取的最佳工藝及工藝參數(shù)，為馬齒莧的進一步開發(fā)利用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬齒莧全草 新鮮野生，采摘于吉林省長春市高新區(qū)，將馬齒莧全草洗凈晾干，然后用多功能食物料理機將其粉碎至粉末狀，過80目標(biāo)準(zhǔn)篩，備用;石油醚(分析純) 天津化學(xué)試劑有限公司;鹽酸(分析純) 北京化工廠;乙酸乙酯(分析純) 哈爾濱市新達(dá)化工廠;氯仿、氨水(化學(xué)純) 開原市化學(xué)試劑一廠;碘化鉍鉀(分析純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;無水乙醇(分析純) 淄博市臨淄云天化工廠。

電子天平 AL104，梅特勒－托利多儀器有限公司;電熱恒溫水槽 DK－8D型，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE－52型，上海亞榮生化儀器廠;紅外光譜儀 Spectrum One FTIR型，美國 Perkin Elmer儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬齒莧生物堿提取液的制備 準(zhǔn)確稱取50g馬齒莧粉末，放入500mL燒杯中，室溫下浸泡1h后，在實驗設(shè)計要求的條件下回流提取(水浴溫度使得乙醇微沸)，提取結(jié)束后，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至膏狀，放冷，加3%HCl 100mL溶解，抽濾除去不溶物。提取液用氯仿25mL萃取兩次，棄去氯仿層。用濃氨水調(diào)pH9～10，加入25mL乙醚萃取三次，棄去乙醚層。再加入30mL氯仿萃取，每次萃取30min，直至無生物堿為止，合并萃取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸干，回收溶劑，用20mL甲醇將容器壁上的萃取物溶解，置于超聲波清洗器中洗脫備用。

1.2.2 馬齒莧生物堿最大吸收波長的確定 取處理后的樣品1mL，加入5mL氯仿及1mL溴甲酚綠緩沖溶液于分液漏斗中，搖勻、靜置，取4mL氯仿層于刻度試管，加入1mL無水乙醇，搖勻，在UV2550紫外可見分光光度計上測定馬齒莧生物堿的最大吸收波長為620nm。

1.2.3 提取液吸光度的測定 通過紫外可見分光光度計測定提取液在最大吸收波長下的吸光度值。由于缺少馬齒莧生物堿的標(biāo)準(zhǔn)品，本文通過測定吸光度來評價提取效果。

生物堿可與溴甲酚綠等顯色劑反應(yīng)生成難溶于水的顯色絡(luò)合物，對于大多數(shù)生物堿可采用此法作為提取效果的評價指標(biāo)。而本文通過全波長掃描圖得到馬齒莧生物堿與顯色劑反應(yīng)后的最大吸收波長為620nm，根據(jù)文獻報道，此處為生物堿絡(luò)合物的特征吸收峰，且這與王仲英等［11－12］的研究結(jié)論(634nm)相近，因此可用此波長測定馬齒莧生物堿的含量。

1.3 單因素實驗

以最大波長620nm處的吸光度值為指標(biāo)，研究料液比、超聲波作用時間、回流時間、乙醇濃度各個因素的影響規(guī)律。

1.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗

采用Design－Expert軟件研究乙醇濃度、超聲波作用時間、回流時間、料液比各個因素的影響規(guī)律。采用中心組合BoxBehnken設(shè)計方案，采用4因素3水平的響應(yīng)面表安排實驗，見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平

1.5 紅外光譜的測定

提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)除去甲醇，經(jīng)干燥后，取1mg樣品與少量的KBr研磨，以壓片法在4000～400cm－1的區(qū)間進行紅外光譜掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性檢測結(jié)果

采用生物堿沉淀試劑對馬齒莧粗提液進行化學(xué)成分檢識。向馬齒莧萃取液中分別加入碘化鉍鉀試劑和碘－碘化鉀試劑，觀察反應(yīng)現(xiàn)象。加入碘化鉍鉀試劑生成黃褐色沉淀，加入碘－碘化鉀試劑后生成棕紅色沉淀，根據(jù)實驗現(xiàn)象可確定萃取液中含有生物堿［13］。

2.2 單因素實驗及分析

2.2.1 料液比對生物堿提取效果的影響 在乙醇濃度為75%，室溫浸泡1h后，超聲波作用10min，回流提取1h，研究不同料液比對馬齒莧生物堿提取效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比的影響

由圖1可知，當(dāng)料液比為1∶10時提取效果最佳。

2.2.2 超聲波作用時間對生物堿提取效果的影響在乙醇濃度為75%，料液比為1∶10，室溫浸泡1h后，回流提取1h，研究超聲波作用時間對馬齒莧生物堿提取效果的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波時間的影響

由圖2可知，超聲波作用時間10min時提取效果較好，延長時間，提取效果反而有降低的趨勢，所以超聲時間選擇10min為宜。

2.2.3 回流時間對生物堿提取效果的影響 在乙醇濃度為75%，料液比為1∶10，室溫浸泡1h后，超聲波作用時間為10min，研究不同回流時間對馬齒莧生物堿提取效果的影響，結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果表明，回流時間為2h時，生物堿提取的效果達(dá)到最大，延長時間其變化趨于平緩，從節(jié)約能源及工作效率等角度考慮，最佳時間選擇為2h。

圖3 回流時間的影響

2.2.4 乙醇濃度對生物堿提取效果的影響 在料液比為1∶10，室溫浸泡1h后，超聲波作用10min，回流提取2h，研究乙醇濃度對馬齒莧生物堿提取效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 乙醇濃度的影響

由圖4可以看出，隨著乙醇濃度的增加，提取效果顯著增加，當(dāng)乙醇濃度為85%時，生物堿的提取效果達(dá)到最佳，故本實驗選用最佳的乙醇濃度為85%。

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用中心組合BoxBehnken設(shè)計方案，以馬齒莧總生物堿提取率為指標(biāo)，研究乙醇濃度、超聲波作用時間、回流時間、料液比各個因素的影響規(guī)律，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果

四個因子經(jīng)回歸擬合后，各實驗因子對響應(yīng)值的影響可用如下回歸方程表示:

由表3可知，上述模型的一次項A不顯著，B、C顯著，而D極為顯著;二次項B2、C2顯著，而D2極為顯著;交互項BD顯著。模型的F值為42.27，整體模型的顯著水平p＜0.0001，表明該模型顯著。模型的R2為0.9769，R2(Adj)為0.9538，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程代替真實實驗點進行分析。

按照得到的數(shù)學(xué)模型繪制響應(yīng)曲面圖，見圖5。

圖5 各因素對提取率影響的響應(yīng)面圖

圖5直觀地給出了各個因子交互作用的響應(yīng)面和等值線分析圖。從響應(yīng)面的最高點和等值線可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點。從圖中可以直觀地看出，乙醇濃度、回流時間、超聲波時間及料液比對馬齒莧生物堿的提取率都有影響，除乙醇濃度外其他因素影響都較明顯，特別是料液比與提取時間的交互作用影響較大，在響應(yīng)曲面圖中表現(xiàn)為曲面坡度大，變化明顯。

2.4 條件優(yōu)化

從響應(yīng)面可以看出，最佳值點并不在實驗設(shè)計范圍內(nèi)，故對邊界值和求得的極值進行分析，得到最優(yōu)的提取條件為 A=94.96%，B=1.00h，C= 15.00min，D=1∶10.00，Y=0.828474。按照以上條件(A=95%，B=1h，C=15min，D=1∶10)進行驗證實驗，重復(fù)三次。其平均A620為0.830，與理論預(yù)測值相符。

2.5 生物堿紅外光譜圖

取上述純化生物堿少許，與KBr混勻，以壓片法測定紅外光譜圖，見圖6。

由圖6可知，3435cm－1處可能是酰胺的N－H伸縮振動引起的吸收峰，2398cm－1可能為－N－H伸縮振動引起的吸收峰，1630cm－1可能是酰胺的C=O伸縮振動引起的吸收峰，1385cm－1可能是酰胺C－N的伸縮振動引起的吸收峰，825cm－1可能是C－N彎曲振動引起的吸收峰［14］。從譜圖分析其結(jié)果，該物質(zhì)可能為酰胺類結(jié)構(gòu)，基本符合生物堿的特征結(jié)構(gòu)，從而確定提取出的主要成分可能為生物堿類物質(zhì)。

表3 生物堿得率回歸模型方差分析表

圖6 生物堿紅外光譜圖

3 結(jié)論

超聲波輔助提取技術(shù)作為一種天然產(chǎn)物活性成分分離提取的新技術(shù)，具有方便、高效的特點和較高的實用價值，其對馬齒莧中總生物堿的提取具有高效率、無污染等優(yōu)點，為工業(yè)化生產(chǎn)生物堿產(chǎn)品提供了有益的參考。Design－Expert處理系統(tǒng)是集操作簡單、界面可視化、功能強大于一身的統(tǒng)計分析軟件。經(jīng)過優(yōu)化后的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度為95%，料液比為1∶10，超聲波作用時間為15min，提取時間為1h，此時，馬齒莧生物堿的提取效果最佳。此法使得馬齒莧總生物堿的得率得到了很大的提高［15］，其原因可能是超聲波作用而引起的，且本文采用了先進的分析軟件進行了分析，快速有效地確定了最佳提取條件。此工藝雜質(zhì)較少，易于分離，為下一步的分離純化及功能性研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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Study on ultrasonic extraction technology of total alkaloids from Portulaca oleracea L.

XU He1，ZHANG Hai－yue1，*，CAI Miao2
(1.College of Chemical and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，China;
2.The Retired People in Army Residents of Jilin，Changchun 130061，China)

The extraction process of total alkaloids from Portulaca oleracea L by the ultrasonic extraction was studied.Based on single factor test，response surface methodology(RSM)was used to study effects of ethanol concentration，solid－liquid ratio，extraction time and ultrasonic extraction time on extraction rate of total alkaloids. The best extraction conditions were determined as below:ethanol concentration 95%，ratio of the material－liquid 1∶10(g/mL)，ultrasonic extraction time 15min，extraction time 1h.

Portulaca oleracea L.;alkaloids;ultrasonic extraction;response surface method

TS201.1

B

1002－0306(2011)07－0316－04

2010－07－15 *通訊聯(lián)系人

徐鶴(1984－)，女，研究生，主要從事功能食品及農(nóng)副產(chǎn)品的深加工方面的研究。