幾種激發(fā)子處理對蘋果梨采后青霉病的控制

楊志敏，畢 陽，李永才，陳松江，尹 燕，范存斐，王云飛，張祖斌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

幾種激發(fā)子處理對蘋果梨采后青霉病的控制

楊志敏，畢 陽，李永才*，陳松江，尹 燕，范存斐，王云飛，張祖斌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

研究了β－氨基丁酸(BABA)、水楊酸(SA)、Na2SiO3和NO供體硝普鈉(SNP)處理對蘋果梨抗青霉病誘導(dǎo)的時效性及其作用機(jī)理。結(jié)果表明，各激發(fā)子處理后不同時間損傷接種均能不同程度地抑制擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)的侵染和擴(kuò)展，處理后18h接種各處理的病斑直徑明顯低于對照，其中BABA處理效果最為明顯，病斑直徑比對照降低了14.59%，SNP次之。進(jìn)一步研究表明，各激發(fā)子處理對果實組織抗性相關(guān)酶過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)均有一定的影響，其中SNP能明顯提高POD活性，PAL活性能顯著地被SNP和BABA誘導(dǎo)，而對于PPO活性，SNP和Na2SiO3處理的誘導(dǎo)作用高于BABA和SA。

蘋果梨，激發(fā)子，擴(kuò)展青霉，抗性相關(guān)酶

蘋果梨(Pyrus bretchneideri cv.Pingguoli)是甘肅省名優(yōu)特產(chǎn)，頗具市場聲譽(yù)。其雖具良好的耐貯性，但貯藏后期腐爛仍很嚴(yán)重，其中擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)引起的青霉病是其主要的采后病害［1］。采用化學(xué)殺菌劑可有效控制青霉病，但由于殺菌劑殘留、環(huán)境污染及產(chǎn)生抗藥性等問題使其應(yīng)用受到了限制。因此，尋找新的、更安全有效的果蔬防腐措施已成為當(dāng)前生產(chǎn)中亟待解決的問題［2］。近年來，用各種誘導(dǎo)劑處理來提高產(chǎn)品抗病性已成為果蔬采后防腐的研究熱點。β－氨基丁酸(BABA)作為一種對環(huán)境安全且具高效誘抗作用的非蛋白氨基酸類誘抗劑，能誘導(dǎo)番茄等果蔬對卵菌或真菌病害的系統(tǒng)獲得抗病性［3］。水楊酸(SA)被認(rèn)為是誘發(fā)植物系統(tǒng)獲得抗病性(SAR)的信號物質(zhì)，能誘導(dǎo)黃瓜［4］、柑 桔 和 馬 鈴 薯［5］、香 蕉［6］、獼 猴 桃［7］和 蘋 果梨［8］等果蔬對采后病害產(chǎn)生抗性。硅作為地殼中存在的第二大類元素，研究表明可用于植物病害的控制［9］，其中作為一般認(rèn)為安全物質(zhì)(GRAS)的Na2SiO3采后處理可明顯抑制哈密瓜黑斑病、白霉病和粉霉病［10］、蘋果梨黑斑病［11］以及馬鈴薯塊莖干腐病［12］、蘋果梨青霉病［13］等。NO 是一類脂溶性可擴(kuò)散小分子物質(zhì)，作為信息傳遞的信使分子，不僅參與植物生長和發(fā)育等生理代謝過程［14］，而且對植物的抗逆性具有一定的作用［15］，它是植物和病原物互作過程中的一種信號分子［16，18］。本研究擬采用SNP、Na2SiO3、BABA和 SA等幾種激發(fā)子，研究其對蘋果梨果實抗青霉病的誘導(dǎo)以及對抗病相關(guān)酶活性的影響，以期為采后蘋果梨青霉病的控制篩選低毒、安全的防腐劑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試蘋果梨(Pyrus bretchneideri cv.Pingguoli)采自甘肅景泰縣條山農(nóng)場，單果包紙，紙箱包裝后運抵實驗室冷藏待用;供試擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum) 參照方中達(dá)［19］的方法分離自自然發(fā)病蘋果梨果實，純化鑒定后PDA上保存待用;硝普鈉(SNP)、水楊酸(SA) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;硅酸鈉(Na2SiO3) 天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;β－氨基丁酸(BABA) sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 激發(fā)子處理對蘋果梨損傷接種病斑直徑的影響 參考劉志等［20］的方法并改進(jìn)，選擇外觀整齊、無病蟲害的蘋果梨洗凈后晾干，75%酒精表面消毒后，用滅菌打孔器在蘋果梨表面等距離打孔4個，深度為 3mm。1h后將濃度 為 100μmol/L的 SNP、100mmol/L的 Na2SiO3、500μmol/L的 SA 和50mmol/L的BABA各20μL注入孔內(nèi)，取另一組作為對照，加入等量的無菌水。分別于6、12、18、24h后用微量加樣器接入1×106個/m L的孢子懸浮液20μL，晾干后用聚乙烯袋包裹，然后在室溫下貯藏并觀察發(fā)病情況，采用十字交叉法測量病斑直徑并記錄結(jié)果。每處理用果實10個，重復(fù)三次。

1.2.2 酶液提取及酶活性測定

1.2.2.1 粗酶液的制備 取經(jīng)不同激發(fā)子處理后0、6、12、18、24、48h 的果實，在果皮面下 1mm 處取果肉組織樣品3g，用錫箔紙分包，包好后立即用液氮冷凍，并保存在－85℃超低溫冰箱中備用，每個處理用果10個。參照曹建康等［21］的方法并做修改:取保存待測的果肉組織3g于預(yù)冷的研缽中，加入4m L提取緩沖液，在冰浴條件下充分研磨成勻漿，在4℃，12000×g條件下離心15m in，上清液為粗酶液。

1.2.2.2 酶活的測定 POD和PPO活性測定均參照曹建康等［21］的方法，分別以每分鐘反應(yīng)體系在波長470nm和420nm處吸光度值讀數(shù)變化增加1所需的酶量為一個酶活單位，單位是(ΔOD470/m in·mg蛋白質(zhì)和ΔOD420/m in·mg蛋白質(zhì))。PAL活性測定參照曹建康等［21］的方法并修改，以每小時反應(yīng)體系在波長290nm處吸光度值讀數(shù)變化增加1所需的酶量為一個酶活單位，單位是(ΔOD290/h·mg蛋白質(zhì))。

1.2.2.3 蛋白含量及標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 蛋白質(zhì)含量測定參照曹建康等［21］的方法，同時標(biāo)準(zhǔn)曲線以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，計算蛋白含量。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行分析，并計算標(biāo)準(zhǔn)誤差(±SE)。采用 SPSS Statistics 16.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 激發(fā)子處理對蘋果梨抗青霉病的誘導(dǎo)效果

各激發(fā)子處理后不同時間接種青霉病菌的果實，24h內(nèi)均能不同程度地防止青霉病菌的侵染和擴(kuò)展(圖1)。處理后12h內(nèi)損傷接種4種激發(fā)子的誘導(dǎo)效果均不明顯，隨著時間延長，病斑直徑除BABA處理外，其它均呈先降低后趨于平緩的趨勢，其中18h的誘導(dǎo)效果較好，而BABA處理24h接種效果最好，比對照降低了13.8%。

圖1 激發(fā)子處理對蘋果梨抗青霉病的時效性

從圖2可知，處理后18h接種各激發(fā)子對青霉病菌的擴(kuò)展均存在不同程度的抑制作用。SA、Na2SiO3、SNP和BABA處理的病斑直徑分別比對照降低5.99%、6.15%、7.10%、14.59%，其中BABA處理的誘導(dǎo)效果顯著高于對照和其它激發(fā)子處理。

圖2 激發(fā)子處理后18h接種對蘋果梨青霉病的控制效果

2.2 激發(fā)子處理對蘋果梨組織抗性相關(guān)酶活性的影響

2.2.1 激發(fā)子處理對蘋果梨POD活性的影響 各激發(fā)子處理對蘋果梨組織POD活性均有一定的影響(圖3)。處理后18h之前除SNP處理的POD活性高于對照外，其余各處理均與對照無明顯差異。在處理后18h各處理的POD酶活性均下降，達(dá)到最小值。隨后各處理POD活性均呈先上升后下降的趨勢。其中Na2SiO3和SNP處理明顯增強(qiáng)了果實組織的POD活性，處理后24h高出對照21.95%和26.03%。都呈單峰曲線。在處理后12h到18h PPO酶活性急劇上升，18h時各處理酶活性均達(dá)到最大值，其中Na2SiO3處理果實的PPO活性在18h明顯高于對照及其它處理，其酶活性比對照高20.47%。隨后各處理的酶活性均呈現(xiàn)下降趨勢，其中SNP處理的酶活性下降緩慢，在處理后24h和48h較其它處理均保持較高的酶活性，其酶活性值分別較對照高出29.42%和14.56%。

圖3 不同激發(fā)子處理對蘋果梨POD酶活性的影響

2.2.2 激發(fā)子處理對蘋果梨PPO活性的影響 從圖4可以看出，不同激發(fā)子處理的果實PPO活性基本

圖4 不同激發(fā)子處理對蘋果梨PPO酶活性的影響

2.2.3 激發(fā)子處理對蘋果梨PAL活性的影響 SA、Na2SiO3、SNP和BABA 4種激發(fā)子處理雖對蘋果梨果實組織PAL活性均有一定的影響，但各處理對酶活性影響的變化趨勢各不相同(圖5)。處理后48h內(nèi)，除SA和BABA平穩(wěn)波動上升外，Na2SiO3與對照趨勢相似且低于對照，24h時SNP處理的峰值最高，高出對照44.86%，SNP和BABA在48h酶活均顯著高于對照，約高出對照1.19倍。

圖5 不同激發(fā)子處理對蘋果梨PAL酶活性的影響

3 討論

隨著誘導(dǎo)抗性在果實采后病害控制中應(yīng)用的增多，誘導(dǎo)因子的篩選及其作用機(jī)理的研究越來越被廣泛關(guān)注。許多研究表明，SA［22］和 NO［17－18］處理能夠激活植物過敏性反應(yīng)和獲得性系統(tǒng)抗性的提高，是重要的信號分子。本實驗中用SA和SNP處理蘋果梨果實，降低了擴(kuò)展青霉對果實的危害程度，說明SA和SNP能誘導(dǎo)蘋果梨產(chǎn)生抗病性，激活組織自身的防御反應(yīng)，這與劉志［20］、王芳芳［23］在富士蘋果及 Tian等［24］在梨上的結(jié)果相似。BABA作為非蛋白類氨基酸，能誘導(dǎo)植株細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生胼胝質(zhì)，形成乳突或?qū)е录?xì)胞木質(zhì)化等，具有防止侵染和增強(qiáng)抗病性作用的結(jié)構(gòu)［25］。本實驗中BABA處理能有效控制蘋果梨青霉病是對上述結(jié)論的有力證明。同時發(fā)現(xiàn)Na2SiO3處理能夠抑制蘋果梨的青霉病，該結(jié)果與前人在蘋果梨［10］、馬鈴薯［11］和甜瓜［26］上的研究結(jié)果相一致，表明Na2SiO3處理能有效地控制果蔬采后病害的發(fā)生。

POD是寄主植物細(xì)胞內(nèi)抵御活性氧傷害的主要保護(hù)酶，在阻止活性氧形成和清除活性氧中起重要作用，與植物的抗病反應(yīng)密切相關(guān)。一般認(rèn)為，POD活性的提高是果實抗病性被誘導(dǎo)的重要生化指標(biāo)［12］。PPO是酚類物質(zhì)氧化的主要酶，在植物體內(nèi)催化酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生醌類，并參與木質(zhì)素合成，以殺死或抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用［27］。本實驗中Na2SiO3和SNP處理明顯促進(jìn)了果實體內(nèi)POD和PPO活性增加，表明其誘導(dǎo)了蘋果梨的抗病性，這與 Na2SiO3處理馬鈴薯［11］、哈密瓜［12］以及 SNP 處理富士蘋果［20］結(jié)果相一致。PAL則是苯丙烷類代謝途徑中的第一個關(guān)鍵酶，與植保素、木質(zhì)素及酚類化合物的形成密切相關(guān)，在PAL的作用下，苯丙氨酸脫氨基可以生成酚類和其他具有抗菌活性的物質(zhì)，它們對抑制病原菌具有明顯的作用［28］。在實驗中，蘋果梨果實經(jīng)SA、Na2SiO3、SNP和BABA處理后，均可不同程度地提高PPO、POD、PAL三種酶的活性水平，但各個處理對不同酶的活性影響的變化模式和程度有所不同。綜上所述，四種激發(fā)子雖然能誘導(dǎo)蘋果梨使其產(chǎn)生抗病反應(yīng)，對蘋果梨青霉病進(jìn)行控制，但其誘導(dǎo)機(jī)理可能存在差異，尚有待進(jìn)一步的研究。

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Inhibiting effect of several elicitors treatment on blue mould of Pingguolipear

YANG Zhi－min，BI Yang，LI Yong－cai*，CHEN Song－jiang，YIN Yan，F(xiàn)AN Cun－fei，WANG Yun－fei，ZHANG Zu－bin

(College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

Induction disease resistance against bluemould in Pingguoli pear by different elicitors，such as β－aminobutyric acid(BABA)，salicylic acid(SA)，sodium silicate and nitric oxide(NO)donor sodium nitroprusside(SNP)treatment at different time intervals after treatment and their possible mechanism s were studied.The results showed that there was a different reduction level in lesion diameter of Pingguolipear treated with four elicitors at different time intervals after treatment.BABA showed the best result in reducing lesion diameter by 14.59%com pared with the control，and then the inhibiting effect of SNP was better than others at 18h after treatments.Further studies showed that peroxidase(POD)，polyphenol oxidase(PPO)and phenylalanine ammonialyase(PAL)of the fruit tissue were affected by elicitors.SNP could increase the activity of POD enzyme，PAL activity could be significantly induced by SNP and BABA，SNP and Na2SiO3were better than BABA and SA treatments in induction of PPO activity increase.

Pingguolipear;elicitor;Penicillium expansum;resistant related enzyme

TS255.3

A

1002－0306(2011)07－0379－04

2010－07－06 *通訊聯(lián)系人

楊志敏(1985－)，女，碩士研究生，主要從事采后生物學(xué)方面的研究。

國家自然科學(xué)基金(30960243)。