PLACKETT-BURMAN設計和響應面法優化火紅密孔菌發酵產漆酶培養基

張田田，沈明浩

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118)

PLACKETT-BURMAN設計和響應面法優化火紅密孔菌發酵產漆酶培養基

張田田，沈明浩*

(吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春 130118)

目的:借助MINITAB15.0，采用Plackett－Burman實驗設計法及響應面分析法，對影響火紅密孔菌發酵產漆酶的培養基成分進行優化研究。方法:首先利用Plackett－Burman實驗設計篩選出影響產酶的三個主要因素，即麥麩、葡萄糖和蛋白胨。在此基礎上用最陡爬坡實驗逼近最大響應區域，再利用Box－Behnken實驗設計及響應面分析法進行回歸分析。結果:麥麩、葡萄糖和蛋白胨與漆酶活力存在顯著的相關性，通過求解回歸方程得到優化發酵條件:麥麩2.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.2%，pH自然。此時，漆酶活力達到最大值330.66U/mL，與初始設計發酵培養基中(238U/mL)相比漆酶活力提高了38.9%。結論:首次利用數學統計方法優化了火紅密孔菌發酵產漆酶培養基，并建立數學模型，為該菌株漆酶的工業應用提供了一定的理論依據。

漆酶，響應面法，Plackett－Burman，火紅密孔菌

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶(EC1.10.3.2)，廣泛存在于真菌、植物、細菌中［1－3］，但其中最主要的生產者是擔子菌中的白腐菌。漆酶與木素過氧化物酶、錳過氧化物酶同屬于木質素降解酶類［4］。漆酶的作用底物非常廣泛，能催化酚、芳胺、羧酸等6大類250多種物質發生羥基自由基介導的羥化、歧化、聚合等反應［5］;特別是能有效降解環境污染物如二惡英、多氯聯苯、DDT等［6］。漆酶研究已有一百多年的歷史，是人類研究最早的酶之一，因其較強的氧化還原能力，和其在環境保護、生物檢測、造紙工業、食品工業等領域中的應用而受到人們的廣泛關注。實驗菌株火紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr)來源于中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所，是屬于擔子菌綱，多孔菌科的一種腐生真菌。已有文獻報道，該菌株可合成具有抗菌活性的物質，且能生產多種具有工業價值的酶類［7］。漆酶是火紅密孔菌分泌的多種胞外酶的一種，具有重要的工業應用價值，對偶氮、三苯甲烷和蒽醌素都有很好的降解作用［8］。目前，國內極少見火紅密孔菌發酵產漆酶營養條件的研究報道，本實驗在Plackett－Burman實驗設計的基礎上，對影響火紅密孔菌產漆酶的麩皮、葡萄糖及蛋白胨三個主要因素進行Box－Behnken實驗設計，并采用響應面分析法對三者之間的相互作用進行了回歸分析，對漆酶的工業生產具有一定的參考價值。本實驗的實驗設計及結果分析是由軟件MINITAB 15.0輔助完成的。

表1 N=12的Plackett－Burman的實驗設計及響應值

表2 Plackett－Burman實驗設計的因素水平及效應分析

1 材料與方法

1.1 實驗材料

火紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr)

中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所;斜面種子培養基 馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，VB10.001%，瓊脂2%;液體種子培養基 馬鈴薯20%，葡萄糖2%，酵母浸粉1%;初始設計發酵培養基 同液體種子培養基。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵培養 250m L三角瓶中裝液體培養基100m L，接入 6～7日齡平板菌種 3～5片(8mm)，130 r/m in、32℃下恒溫振蕩培養。

1.2.2 粗酶液制備 取培養7～10d的發酵液，1000 r/m in離心10m in，上清即為粗酶液，冰箱保存備用。

1.2.3 酶活測定 參照吳涓［9］、王宜磊［10］的漆酶活力測定方法(略改):0.1mol/L pH4.6的醋酸緩沖液3.5m L，加入3.36mmo1/L的鄰聯甲苯胺0.5m L，再加入適當稀釋的粗酶液0.1m L，25℃保溫5min，722E型紫外可見分光光度計測595nm處光密度(OD值)，酶活力以樣品與底物反應5min后光密度的改變值表示，以每分鐘光密度增加0.001為一個酶活力單位(U/m L)。

2 結果與分析

2.1 Plackett－Burman設計篩選產酶重要影響因子

通過查閱大量文獻，并在前期實驗的基礎上，本實驗選取可能影響產酶的8個因素:葡萄糖(A)、淀粉(B)、麩皮(D)、酵母浸粉(E)、酒石酸銨(G)、蛋白胨(H)、MgSO4·7H2O(J)、KH2PO4(K)進行實驗次數N=12的Plackett－Burman實驗。8個因素分別對應于表中的8個列，每個因素取低水平“－1”和高水平“1”。另設3個虛擬列，考察實驗誤差。以漆酶活力為響應值，對實驗結果進行分析，得出各因素的t值和可信度水平。一般選擇可信度大于90%以上的因素作為重要因素。實驗設計及結果見表1，各因素主效應分析見表2。

由表2的主效應分析結果可知，在PB設計的二水平范圍內，影響火紅密孔菌發酵產漆酶的重要因素為葡萄糖、麩皮和蛋白胨的濃度，其可信度均在90%以上。考慮到發酵培養基的碳源、氮源均已確定，而其他因素對漆酶活力的影響不顯著，為避免實驗資源的浪費，發酵培養基組成確定為麥麩、葡萄糖和蛋白胨。故在下一步響應面分析中只考察麥麩、葡萄糖和蛋白胨濃度的最優水平。

表5 回歸模型方差分析

2.2 最陡爬坡實驗設計及結果

響應面擬合方程只有在考察的臨近區域內才能充分近似真實情形，所以要先逼近最佳區域后才能建立有效的響應面擬合方程［11］。因此根據Plackett－Burman實驗篩選出的顯著因子，設計它們的變化方向及步長進行最陡爬坡實驗是很有必要的，實驗設計及結果見表3。由表3可知，最優發酵條件可能在實驗3附近，故以實驗3的條件為響應面實驗的中心點。

表3 最陡爬坡實驗設計及結果

2.3 響應面設計確定顯著因子的最佳值

由最陡爬坡確定的實驗因素中心點，根據Box－Behnken的中心組合設計原理，設計了三因素三水平運行次數為15次的響應面分析實驗。麥麩濃度x1(%)，葡萄糖濃度x2(%)和蛋白胨濃度x3(%)自變量經過下述公式分別進行編碼轉換:A=x1－2.5;B=x2－2;C=(x3－1.2)/0.2。實驗設計及結果見表 4。9.00B－7.00C－25.17A2－64.17B2－61.17C2+22.00AC+6.00BC。其中Y為預計響應值，A、B、C為變量的編碼值。

表4 響應面Box－Behnken設計矩陣和實驗結果

對結果進行方差分析(表5)可知，方程的顯著統計程度較高，失擬項為0.335?0.05，模型決定系數R2=99.32%，表明回歸方程有較好的擬合度，因此可用該回歸方程代替實驗真實點對火紅密孔菌發酵產漆酶進行分析和預測。

對回歸方程求一階偏導數可得模型的極值點，分別為:A=0.0230，麥麩濃度為2.523%，B=0.0678，葡萄糖濃度為2.068%，C=－0.0497，蛋白胨濃度為1.190%。其相對應的響應值為347.84U/m L。考慮到實際操作的可行性，將火紅密孔菌發酵培養基的成分在理論值基礎上修正為:麥麩2.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.2%，pH自然。在上述條件下對模型預測值進行實驗驗證，漆酶活力為330.66U/m L，實驗值與理論值誤差在5%之內，屬正常范圍，可見模型可以較好地預測實際發酵情況。

根據回歸方程利用MINITAB 15.0繪出響應面圖，即圖1～圖3。每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在最佳水平。由圖1顯示，蛋白胨含量為1.2%時，葡萄糖與麩皮含量對火紅密孔菌發酵產漆酶活力的影響。由圖1可知，葡萄糖對漆酶活力的影響極其顯著，表現為較陡的曲面;麥麩含量對漆酶活力影響較小，曲面較平滑。圖2顯示，葡萄糖含量為2.0%時，麩皮與蛋白胨含量對漆酶活力的影響。由圖2可知，蛋白胨含量對漆酶活力的影響較為顯著，曲面變化幅度大;當蛋白胨含量較低，而麥麩含量較高時，顯著降低了漆酶的活力，不利于火紅密孔菌漆酶的分泌。圖3顯示了葡萄糖與蛋白胨交互作用對漆酶活力的影響。從圖3可以看出，葡萄糖和蛋白胨含量取某適中值時會使漆酶活力達到最大值，且過高或過低都會使漆酶活力降低。

利用統計軟件MINITAB 15.0對實驗數據進行二次多項回歸擬合，回歸模型為:Y=347.33+2.50A+

圖1 漆酶活力與葡萄糖，麥麩的響應曲面圖

圖2 漆酶活力與蛋白胨，麥麩的響應曲面圖

圖3 漆酶活力與蛋白胨，葡萄糖的響應曲面圖

3 結論

火紅密孔菌是一種較為常見的腐生真菌，可導致木材的白色腐朽，廣泛存在于我國東北林區。火紅密孔菌在固體和液體發酵基質中均可發酵生產漆酶。已有文獻報道，在誘導條件下火紅密孔菌可產生多種亞型的漆酶，且在最優誘導條件下漆酶活力為1368U/L［12］。本文通過大量預實驗，選取對漆酶活力有影響且較為常見的碳源和氮源對火紅密孔菌發酵產漆酶培養基進行優化。Plackett－Burman實驗結果顯示，相對其他碳源而言，葡萄糖對漆酶活力影響較為顯著，而氮源中蛋白胨的影響較為顯著，這與方華等［13］的研究報道相一致。響應面的結果顯示，葡萄糖濃度、蛋白胨濃度及麥麩濃度與漆酶活力存在顯著線性關系，其中葡萄糖濃度與麥麩濃度呈正相關，蛋白胨濃度呈負相關，表明高碳低氮有利于火紅密孔菌漆酶的分泌，而麥麩浸出液中豐富的營養成分也為漆酶的分泌提供了有利條件。圖1～圖3顯示，麥麩、葡萄糖和蛋白胨三者濃度均存在最佳值，在小于或大于最佳值時漆酶活力均有所下降。可能原因是當濃度小于最佳值時，營養成分供給不足，菌體生長緩慢;而當濃度大于最佳值時，菌體大量生長，兩者菌體密度均不適合發酵產酶，因此酶活力下降。

發酵培養基的優化是多因素多水平實驗設計，單因素實驗和正交實驗工作量大且難以得到較快較好的結果。本文將Plackett－Burman設計與響應面分析法相結合，可以快速、有效地從影響火紅密孔菌發酵產漆酶的因素中篩選出主要影響因素，避免了非主要因素可能造成的時間和資源的浪費，并且可實現條件優化，優化的預測結果與實驗結果吻合性也較好。

經過優化，確定了火紅密孔菌的最佳產酶培養基為:麥麩2.5%，葡萄糖2.0%，蛋白胨1.2%，pH自然。此時火紅密孔菌經發酵所產漆酶的活力為330.66U/m L，與初始設計發酵培養基(238U/m L)相比漆酶活力提高了38.9%。本實驗僅從培養基成分方面對火紅密孔菌產漆酶條件進行了優化，不夠全面，培養條件和誘導劑等方面的相關研究將會陸續進行。

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Optimization of culture medium for laccase production from Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr by Plackett－Burman design and response surface methodology

ZHANG Tian－tian，SHEN ming－hao*

(College of Food Science and Engineering，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，China)

Objective:Drawing assistance from mINITAB 15.0 software，Plackett－Burman experimental design and response surface methodology were applied to optimizing culture medium for laccase production from Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr.Method:The important factors influencing laccase production，which identified by initial experimental design of Plackett－Burman were wheat bran，glucose and pep tone.The path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the three significant factors.Box－Behnken design and response surface analysis were adopted to further investigate the mutual interaction between the variables and obtain optimal values that bring maximum laccase activity.Results:The results showed that wheat bran，glucose and pep tone all had significant influence on the activity of laccase.The optimal conditions for the maximal activity discriminated from the reg ressionequation were:wheat bran 2.5%，glucose 2.0%，pep tone 1.2%，natural pH.The maximum value was 330.66U/m L.Compared with the laccase activity(238U/m L)cultured in fermentation medium it increased 38.9% under the optimal conditions.Conclusion:Culture medium for Laccase production from Pycnoporus sanguineus(Fr.)Murr was optimized for the first time using statistics and the mathematical model for laccase production was established.

laccase;response surface methodology;Plackett－Burman;Pycnoporus Sanguineus(Fr.)

TS201.3

A

1002－0306(2011)09－0223－04

2010－09－01 *通訊聯系人

張田田(1986－)，女，在讀碩士，研究方向:發酵工程，食品安全。

吉林省科技廳課題(20090553)。