酶法交聯對食物蛋白的改性作用研究進展

吳進菊，湯尚文，黃升謀，豁銀強

(襄樊學院化學工程與食品科學學院，湖北襄樊 441053)

酶法交聯對食物蛋白的改性作用研究進展

吳進菊，湯尚文，黃升謀，豁銀強

(襄樊學院化學工程與食品科學學院，湖北襄樊 441053)

食物蛋白通過分子間或分子內的交聯作用，可有效地改善功能特性，有利于在食品加工中的應用。可用于蛋白交聯的酶主要有轉谷氨酰胺酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等。主要闡述了轉谷氨酰胺酶、多酚氧化酶、過氧化物酶交聯蛋白的作用機理及最新研究進展。

交聯，食物蛋白，多酚氧化酶，轉谷氨酰胺酶

蛋白質是人體必需的六大營養素之一，是影響食品質地的重要組分。然而，天然蛋白質的性質無法滿足食品加工的需要，蛋白質改性研究已引起了廣大學者的廣泛重視。蛋白質的改性是指通過物理、化學和生物(酶)的方法改變蛋白質的結構，從而改善它們的功能特性，使之達到食品所需要的品質特性，以擴大蛋白質在不同類型食品體系中的應用范圍［1］。蛋白質的功能特性，與其化學結構、分子大小、表面疏水性等密切相關。蛋白質通過分子間或分子內的交聯作用，分子結構發生明顯變化，分子量大大提高，可有效地改善功能特性，如保水性、乳化性、起泡性、流變學特性及凝膠特性等，減少食品添加劑的使用，有利于在食品加工中的應用。蛋白交聯的方法有化學法、物理法和酶法。利用酶進行蛋白交聯以改良食品的功能特性，比化學法更好，因為酶所需條件溫和，具有較高的特異性，不會產生有毒物質，并且消費者感覺酶比化學劑更“天然”［2］。目前研究發現，可用于蛋白交聯的酶有轉谷氨酰胺酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等，它們可催化蛋白質形成分子內或分子間交聯，從而改善蛋白質的功能特性。

1 轉谷氨酰胺酶對食物蛋白的交聯作用

轉 谷 氨 酰 胺 酶 (Transglutaminase，TG，E.C.2.3.2.13，全稱為蛋白質－谷氨酰胺－γ谷氨酰胺基轉移酶)可催化轉酰胺基反應，形成ε－(γ－谷氨酰胺基)賴氨酸鍵的交聯，從而導致蛋白質(或多肽)之間發生共價交聯形成共價化合物。轉谷氨酰胺酶的作用機理如下［3］∶a.它可催化肽鍵中谷氨酰胺殘基γ－羰基和伯胺之間酰胺基轉移反應(圖1a)，利用該反應可共價導入蛋白質、氨基酸、多肽至同種或異種蛋白，或將氨基糖類、磷脂導入蛋白質形成多相共軛蛋白質，從而改善蛋白質營養特性［4］。b.當蛋白質中賴氨酸殘基γ－氨基作為酰基受體時，蛋白質在分子之內或分子之間形成ε－(γ－谷氨酰胺基)賴氨酸共價鍵(圖1b)。通過該反應蛋白質分子發生交聯，使食品或其他制品發生質構變化，從而賦予產品特有的質構特性和粘合性能。c.當不存在伯胺時，水會成為酰基受體，則谷氨酰胺殘基脫去胺基(圖1c)，該反應可用于改變蛋白質等電點及溶解性。

轉谷氨酰胺酶最初是從哺乳動物的組織中提取得來的，由于提取純化困難，價格較高，從而制約了其在食品加工中的應用。直到1989年，日本人采用微生物發酵的方法大量生產轉谷氨酰胺酶，使轉谷氨酰胺酶的來源得到充分保障，從而推動了轉谷氨酰胺酶交聯蛋白的進一步研究。采用TG對食物蛋白進行交聯，可改良蛋白質的功能特性，如熱穩定性、乳化性、凝膠特性、保水性、流變學特性等。目前，轉谷氨酰胺酶是蛋白質酶法交聯中研究最多、應用最廣的一種酶，已廣泛應用于乳制品、植物蛋白制品、肉制品和焙烤制品中。

圖1 轉谷氨酰胺酶作用機理

Kuraishi等報道采用TG處理乳制作的凝固型酸奶的凝膠強度和攪拌型酸奶的粘性具有更易被人們接受的感官性，因為TG能增加凝膠強度，提高蛋白溶液的粘性，從而提高保水性［4］。Chambi等采用TG催化交聯不同配比濃度的酪蛋白和明膠制備可食用膜，當酪蛋白和明膠配比為75∶25時，可食用膜的延展性能大大提高，而透水性卻大幅度降低［5］。采用TG催化交聯β－乳球蛋白，可以顯著提高其熱穩定性，如聚合度為1%的β－乳球蛋白在100℃下可保持30min不變性，而未交聯的β－乳球蛋白在70℃下就會發生變性［6］。同樣地，脫脂乳經 TG交聯后，在pH6.3～7.1范圍內比未處理乳的熱穩定性更高［7］。Marton等研究發現采用轉谷氨酰胺酶(MTG)和谷胱甘肽(GSH)的共同作用對乳蛋白進行共價交聯，可使乳在不需要預熱處理的情況下就能進行交聯，從而增加外觀粘性，比單獨采用TG處理的乳具有更高的蛋白聚合度［8］。Ozer等建議 TG的使用濃度在9～14U/g蛋白質，以提高凝固型脫脂酸奶的物理、化學和感官特性。而當采用TG+GSH共同作用時，所需的酶濃度較低，只需0.6～1.0U/g蛋白質［25］。莊瑋婧等研究發現TG酶的添加可以明顯提高鰱魚魚丸的持水性、質構特性和感官品質，但對色澤無明顯影響［9］。

2 多酚氧化酶對食物蛋白的交聯作用

多酚氧化酶 (Polyphenoloxidase，PPO，EC 1.14.18.1)，是由核編碼的含銅金屬酶，廣泛存在于各種動物、植物和微生物中。根據作用底物的不同，多酚氧化酶又被習慣地稱為單酚氧化酶、酪氨酸酶、甲酚酶、兒茶酚酶等。近些年來，多酚氧化酶催化蛋白交聯反應引起了學者的廣泛重視。

目前，用于蛋白交聯研究的PPO多是從雙孢蘑菇子實體提取得來的。Onwulata等采用經蘑菇多酚氧化酶交聯的乳蛋白制作凝膠，凝膠粘度顯著增加，將凝膠放置于4℃冰箱保存10d后，凝膠狀態穩定，且粘彈性更高［10］。Burzio等采用蘑菇PPO對棱紋貽貝、智利貽貝和合唱殼菜蛤三種蚌類中的多酚類蛋白質進行交聯，研究發現智利貽貝和合唱殼菜蛤中蛋白質的交聯效果不如棱紋貽貝中好。對交聯蛋白的氨基酸分析表明∶只有多巴含量明顯減少，而其它氨基酸含量變化不大，這說明交聯的形成可能只限于蛋白質分子中多巴衍生物的氧化［11］。Takasaki等研究發現小麥醇溶蛋白經蘑菇PPO交聯后，分子量為20～60ku的峰面積顯著減少，而分子量為300～1000ku的峰面積顯著增加，他們通過進一步的研究表明小麥醇溶蛋白發生了分子內和分子間的交聯［12］。Thalmann等在研究蘑菇PPO對α－乳白蛋白、β－乳球蛋白和溶菌酶的交聯作用時發現，α－乳白蛋白和β－乳球蛋白產生交聯反應的最適pH為4～5，而溶菌酶的最適pH為7.0，其中，α－乳白蛋白經交聯后能產生分子量大于300ku的聚合體［13］。經雙孢蘑菇PPO交聯后酪蛋白的乳化性和乳化穩定性與形成的聚合物含量有著密切的關系，當PPO酶比活力為400U/mL，25℃反應4h時，交聯后酪蛋白的乳化性和乳化穩定性分別為18.3m2/g和19.8min，較未交聯的酪蛋白乳化性和乳化穩定性分別提高了17.3%和37.5%［14］。另外，蘑菇PPO也能催化膠原蛋白發生分子內和分子間的交聯［15］。

由于雙孢蘑菇的栽培具有明顯的季節性，鮮菇不易貯存，且PPO分離純化困難，近年來，少數學者將PPO的來源投向了微生物，采用里氏木霉PPO交聯蛋白。研究表明，里氏木霉 PPO在3h內可使β－酪蛋白產生交聯，但牛血清白蛋白在24h內都不能產生交聯［16］。另外，Monogioudi等研究發現β－酪蛋白經里氏木霉PPO交聯后形成的聚合物分子量大小與酶的加入量和作用時間有關，聚合物分子量在500～1700ku之間，交聯度在21～71之間［17］。

3 過氧化物酶對食物蛋白的交聯作用

過氧化物酶(Peroxidase，POD，E.C.1.11.1.7)是由微生物或植物所產生的一類氧化還原酶，廣泛地分布于自然界中，是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，該酶也可以催化蛋白發生交聯反應。過氧化物酶可氧化酪氨酸殘基，在蛋白質中形成分子間和分子內的二酪氨酸和三酪氨酸結構，從而使蛋白發生交聯作用［18］。

Steffensen等采用灰蓋鬼傘過氧化物酶和 H2O2交聯酪蛋白，經SDS－PAGE電泳檢測發現，天然酪蛋白的量明顯減少，而形成了高分子量的聚合物［19］。在H2O2存在的情況下，采用辣根過氧化物酶對酪蛋白進行交聯作用，酪蛋白的最佳交聯條件是酶加入量4.73μkat/g，酪蛋白濃度5%，pH9.5，37℃反應2.9h;交聯后酪蛋白的乳化性和乳化穩定性分別提高了10%和6%，制作的凝膠微觀結構更緊密、一致［20］。

4 展望

轉谷氨酰胺酶是蛋白交聯中研究最深入、應用最廣的一種酶，已進行商業化生產。相比而言，多酚氧化酶由于來源得不到保障，對蛋白交聯方面的研究相對較少，但也取得了一定的成績，具有廣闊的開發應用前景。而過氧化物酶交聯蛋白方面的報道較少。

目前，酶法交聯食物蛋白方面的研究主要集中在交聯后蛋白功能特性的改變，而對蛋白的營養特性研究較少，交聯后蛋白在體內的消化吸收情況有待于進一步深入的研究。另外，交聯后蛋白功能特性改變的機理尚不明確，交聯后蛋白結構的改變與功能特性的關系有待于進一步研究。

［1］楊曉泉.大豆蛋白的改性技術研究進展［J］.廣州城市職業學院學報，2008，2(3):37－44.

［2］Singh H.Modification of food proteins by covalent crosslinking［J］.Trends in Food Sci Technol，1991，2:196－200.

［3］張紅.蛋白質交聯研究概況［J］.糧食與油脂，2004，12: 16－19.

［4］Kuraishi C，Yamazaki K，Susa J.Transglutaminase:Its utilization in the food industry［J］.Food Reviews Int，2001，17: 221－246.

［5］Chambi H，Grosso C.Edible films produced with gelatin and casein cross－linked with transglutaminase［J］.Food Res Int，2006，39(4):458－466.

［6］劉心偉，呂加平，范貴生.微生物轉谷氨酰胺酶在食品工業中的研究進展［J］.內蒙古農業大學學報，2005，26(4): 54－57.

［7］O’Sullivan M M，Lorenzen P C，O’Connell J E.Influence of transglutaminase on the heat stability of milk［J］.Dairy Sci，2001，84:1331－1334.

［8］Marton P B，Manfred H，Kerstin W.Transglutaminase crosslinking of milk proteins and impact on yoghurt gel properties［J］. Int Dairy J，2007:1－12.

［9］Ozer B，Kirmaci H A，Oztekin S，et al.Incorporation of microbial transglutaminase into non－fat yogurt production［J］.Int Dairy J，2007，17:199－207.

［10］Onwulata C I，Tomasula P M.Gelling properties of tyrosinase－treated dairy proteins［J］.Food Bioprocess Technol，2010(3): 554－560.

［11］Burzio L A，Burzio V A，Pardo J，et al.In vitro polymerization of mussel polyphenolic proteins catalyzed by mushroom tyrosinase［J］.Comp Biochem Phys B:Biochem Mol Biol，2000，126(3): 383－389.

［12］Takasaki S，Kawakishi S，Murata M，et al.Polymerisation of gliadin mediated by mushroom tyrosinase［J］.LWT，2001，34 (8):507－512.

［13］Thalmann C L，L?tzbeyer T.Enzymatic cross－linking of proteins with tyrosinase［J］.Europ Food Res Technol，2002，214 (4):276－281.

［14］吳進菊，高金燕，劉瀟，等.雙孢蘑菇多酚氧化酶交聯作用對酪蛋白乳化性及其穩定性的影響［J］.食品科學，2010，31 (15):117－120.

［15］Dabbous M K.Inter－and intramolecular cross－linking in tyrosinase－treated tropocollagen［J］.J Biol Chem，1966，241 (22):5307－5312.

［16］Mattinen M－L，Lantto R，Selinheimo E，et al.Oxidation of peptides and proteins byTrichoderma reeseiandAgaricus bisporustyrosinases［J］.J Biotechnol，2008，133(3):395－402.

［17］Monogioudi E，Creusot N，Kruus K，et al.Cross－linking of b－casein byTrichoderma reeseityrosinase andStreptoverticillium mobaraensetransglutaminase followed by SEC－MALLS［J］.Food Hydrocolloid，2009，23:2008－2015.

［18］Matheis G，Whitaker J R.Peroxidase－Catalyzed Cross Linking of Proteins［J］.J Protein Chem，1984，3(1):35－48.

［19］Steffensen C L，Mattinen M L，Andersen H J，et al.Crosslinking of tyrosine－containing peptides by hydrogen peroxideactivatedCoprinus Cinereusperoxidase［J］.Eur Food Res Technol，2008，227(1):57－67.

［20］LI J，ZHAO X.Oxidative cross－linking of casein by horseradish peroxidase and its impacts on emulsifying properties and the microstructure of acidified gel［J］.Afr J Biotechnol，2009，8(20):

5508－5515.

Research progress on modification of food proteins by enzymatic cross linking

WU Jin－ju，TANG Shang－wen，HUANG Sheng－mou，HUO Yin－qiang
(College of Chemical Engineering and Food Science，Xiangfan University，Xiangfan 441053，China)

Inter－and intramolecular cross－linking of food proteins can modify their functional properties，which are useful to application in food processing.The enzymes which can be used for protein cross linking are transglutaminase，polyphenol oxidase and peroxidase.Reaction principle of transglutaminase，polyphenol oxidase and peroxidase generated cross－linking of proteins，as well as the latest progresses，were Illustrated.

cross－linking;food proteins;polyphenol oxidase;transglutaminase

TS201.2+1

A

1002－0306(2011)11－0511－03

2011－03－23

吳進菊(1983－)，女，講師，研究方向:食品生物技術。