腹瀉性貝類毒素DSP的磷酸酶抑制檢測法研究

胡雪蓮，曲勤鳳，顧文佳

(上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233)

腹瀉性貝類毒素DSP的磷酸酶抑制檢測法研究

胡雪蓮，曲勤鳳，顧文佳

(上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233)

對腹瀉性貝類毒素DSP的快速篩選方法——磷酸酶抑制法進行了研究，分析了該方法的檢測原理，并提出了該方法的篩選檢出限，對標準溶液、加標回收樣品及市場采樣樣品進行了檢測，并就該方法的重復性進行驗證。檢測結果顯示，磷酸酶抑制法檢測準確率高，重復性較好，提出的篩選檢出限(200μg/kg)遠低于我國相關標準的規定(600μg/kg)，是一種對于腹瀉性貝類毒素DSP較為理想的篩選方法。

腹瀉性貝類毒素，磷酸酶抑制法，篩選檢測

貝類毒素(Shellfish toxin)是一類由浮游藻類或微生物合成，通過食物鏈傳給貝類，并在其體內富集而形成的脂溶性次生高分子化合物。其中，腹瀉性貝類毒素的存在比較普遍［1］。DSP最早由Yasumoto等從紫貽貝的肝胰腺中分離獲得［2］，海產雙殼類、棘皮類、腹足類等軟體動物中都曾檢出該貝類毒素。人類誤食含DSP的水產品后，會產生以腹瀉為主要特征的中毒癥狀。近年來對中國沿海部分海域貝類毒素的調查顯示［3－5］，中國沿海部分海域赤潮活動頻繁，赤潮一旦產生，海產雙殼貝類易受到貝類毒素的威脅。盡管目前還沒有因DSP中毒致死的報道，但由于DSP中毒癥狀與細菌性胃腸炎類似，若是延誤治療，會對健康造成較大的傷害。目前我國DSP的檢測方法及判定標準以小鼠法為主，該方法是AOAC (美國官方化學家協會)的標準方法，同時也是目前唯一被大多數國家所普遍接受的統一方法。但該方法存在著很多不足和缺陷，如∶僅能指出毒性的大小，無法確定毒素的組成和含量;所測得的毒性和小鼠品系有關，可比性較差，必須進行標準毒素校準才有可能相比;檢測耗時較長，重復性差;需要受過專門訓練的操作人員;小鼠維持費用較高，對實驗場地要求較高等［6］。這些不足使得人們希望能有另外一些操作簡便、可比性強、易于普及、對實驗人員和檢測場地要求相對較低的檢測手段來替代小鼠法。本文探討了一種腹瀉性貝類毒素DSP的快速篩選檢測方法——磷酸酶抑制法，旨在較短時間內對貝類樣品中是否含有DSP進行快速篩查，以滿足當前食品安全實時監控的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

高純度DSP單標OA標準溶液 購自瑞士ALEXIS公司，質量為50μg;TOXINLINE－DSP腹瀉性貝類毒素試劑盒 上海千慕生物科技有限公司，樣品前處理及檢測步驟勻按照試劑盒使用說明書進行。

全波長多功能微孔板分析系統 TECAN公司，M200型，選擇激發波長(360±15)nm，發射波長(455±20)nm。

1.2 OA標準溶液的配制

將OA標準品以1mL 100%甲醇溶解，制成OA母液并分裝，－18℃保存待用。使用時，母液以含NaCl(100mmol/L)的Tris－HCl(100mmol/L，pH8.2)稀釋至2μmol/L(約1610ppb)，作為標準品稀釋液及加標添加液。

以含NaCl(100mmol/L)的Tris－HCl(100mmol/L，pH8.2)將上述標準品稀釋液配制成濃度分別為80、100、160、200、240、300μg/kg的OA標準液，使用1.1所述試劑盒對上述OA標準液進行檢測。

1.3 模擬陽性樣品制作

以市售干貝為基質，將其高溫滅活后，以5.0g/管分裝于50mL離心管并高壓處理。向基質中添加OA標準品添加液，使其OA終濃度分別為80、100、120、140、160、200、240、300μg/kg。使用1.1所述試劑盒對上述樣品進行前處理并檢測。

另選擇市售扇貝、蛤蜊、牡蠣，將其洗凈后去除貝殼，取出所有組織。用濾紙吸干貝肉上的水分，充分搗碎混勻，并5.0g/管分裝至50mL離心管并高溫滅活。向上述離心管中添加OA標準品添加液，使OA終濃度分別為100、240μg/kg，并將其作為盲樣，分發給三名檢驗人員，由其分別使用1.1所述試劑盒對樣品進行前處理并檢測。

1.4 市場采樣樣品

在市場上選購了22批次的貝類產品，包括扇貝、文蛤、友蛤、花蛤、白蛤、貽貝、牡蠣等常見品種。將所選購的貝類樣品洗凈后，去除貝殼，取出所有組織。用濾紙吸干貝肉上的水分，充分搗碎混勻，以5.0g/管分裝至50mL離心管并高壓處理。使用1.1所述試劑盒對樣品進行前處理并檢測。

1.5 OA含量計算

以熒光讀數值為Y軸，試劑盒內標準品OA濃度的對數值為X軸，繪制標準曲線，標準曲線計算得出所測樣品中的OA含量。

2 結果與討論

2.1 檢測原理及篩選檢出限的提出

磷酸酶抑制法檢測腹瀉性貝類毒素DSP的基本原理是∶磷酸酶可以水解為一種特殊的酶作用物并產生熒光反應，而DSP毒素的主要活性成分OA及其衍生物DTX可以抑制該酶的活性，其抑制程度與DSP含量相關。因此，由熒光信號的強弱可以檢測磷酸酶水解受抑制的程度，從而確定出樣品中DSP的含量。由于該檢測原理基于DSP的生物毒性機理，因而具備較強的特異性，其它種類的貝類毒素不會對本檢測形成干擾。

腹瀉性貝類毒素是一類成分十分復雜的聚醚類或大環內酯類化合物，一般可分為∶酸性成分OA及其天然衍生物DTX 1～ 3;中性成分聚醚內酯(PTXs);其它成分，如YTX等［7－9］。目前已經證實與腹瀉有關的組分是其中的酸性成分OA及其衍生物DTX－1和DTX－3［9］。其中，小鼠OA的i.v.LD50和i.p.LD99均為200μg/kg，DTX－1 的 i.v.LD50和 i.p.LD99約為160μg/kg，DTX －3 的 i.v.LD50和 i.p.LD99均 為500μg/kg［7，9］。有研究表明，通過共軛物的水解、氧化及非酸形式的酰化作用，可以實現DTX與OA之間的轉化［10］。因此，選擇OA(大田軟海綿酸)作為腹瀉性毒素的標準溶液進行加標回收或制備模擬染毒樣品具有較強的代表性。在天然狀態下，OA及其衍生物可能是在某些藻類的葉綠體中合成［11］，并貯存于其胞質周圍的液泡中［12］，再通過生物鏈到達貝類的腸腺。新鮮貝肉中所可能存在的某些活性酶成分可以降解游離態的OA。在預實驗過程中，曾選用新鮮貝肉作為基質，加標樣品及模擬染毒樣品的回收率均低于50%(數據未顯示)。因此在后期實驗中，均對以上樣品的基質進行高溫滅活處理。

目前已有13個國家或組織制定了貝類中DSP的限量標準，各國對于DSP的限量標準多數基于OA及其衍生物的小鼠i.v.LD50和i.p.LD99量而制定。如FDA、日本、加拿大、澳大利亞、新西蘭、朝鮮等制定的DSP限量為20μg/100g(200μg/kg);EU、德國、葡萄牙、愛爾蘭、英國等制定的DSP中主要毒性成分OA限量為 16μg/100g(160μg/kg)［13］。我國 GB/T 18406.4－2001《農產品安全質量無公害水產品安全要求》規定DSP的限量為60μg/100g(600μg/kg)。參考國內外對貝類中DSP的限量要求，并考慮到本方法的實際檢出限及其主要應用于篩選檢測的特點，將磷酸酶抑制法對貝類產品中DSP的陽性檢出限暫定為200μg/kg。即將篩查結果低于200μg/kg的樣品視為DSP陰性，而檢測結果高于這一數值的樣品視為可疑陽性。

2.2 標準溶液檢測結果

為檢驗磷酸酶抑制法的可靠性，配制了一系列不同濃度的OA標準液，使用1.1所述試劑盒進行檢測，結果如表1所示。

由表1可見，使用磷酸酶抑制法對同一濃度的OA標準溶液進行三次測試，結果具有較好的重復性。檢測所得出的判定結果與標準溶液濃度一致，即∶標準溶液濃度≥200μg/kg的，檢測結果均為陽性;標準溶液濃度低于200μg/kg的，檢測結果為陰性，未出現陰陽性顛倒錯判的情況。三次檢測平均值與實際濃度之間的誤差在±12%之間，即本方法的檢測準確率接近90%。當OA濃度在200μg/kg附近時，判定結果可能出現假陰性或假陽性的情況。當標準溶液濃度較低(＜80μg/kg)時，本方法不易獲得準確的檢測數據，但此現象對檢測結果的判定無影響。

2.3 模擬陽性樣品檢測及重復性驗證結果

考慮到本方法的實際檢測對象為貝類樣品，標準溶液與實物貝類樣品可能會有一定差異。因此選用市售干貝，經高溫滅活后添加OA標準溶液，配制成不同濃度的模擬陽性樣品，使用1.1所述試劑盒進行檢測，檢測結果如表2所示。

由表2可見，對單個濃度的模擬陽性樣品重復多次檢測，結果顯示了良好的重復性。檢測的平均加標回收率在±14%之間。檢測的陰陽性判定結果與加標情況相一致，即∶加標濃度在200μg/kg及以上的，檢測結果均為陽性;加標濃度低于200μg/kg的，檢測結果為陰性，未出現陰陽性顛倒錯判的情況。

表1 標準溶液檢測結果

表2 加標回收樣品檢測結果

以三種市售貝類(扇貝、蛤蜊、牡蠣)為基質，經滅活處理后，分別制成OA濃度為100、240μg/kg的模擬染毒樣品，分別交由三名檢驗人員在盲樣的情況進行檢測，結果如表3所示。

表3 重復性驗證結果

對3種模擬染毒樣品的檢測結果顯示出良好的重復性與較高的加標回收率。而在陰陽性判斷方面，三名檢驗人員的檢測結果完全一致，即∶對于加標濃度為100μg/kg的樣品，判定結果均為陰性;加標濃度為240μg/kg的樣品，判定結果均為陽性。此結果證明，對于DSP含量明顯高于或低于篩選檢出限(200μg/kg)的樣品，磷酸酶抑制法的判定結果是完全正確的。

綜合表1～表3的結果顯示，使用磷酸酶抑制法可以對樣品中是否含有腹瀉性貝類毒素(DSP)進行定性檢測，并可以對樣品中貝類毒素的大致含量進行測定。該方法判定準確率高，僅當DSP濃度在(200±20)μg/kg時，才可能出現假陰性或假陽性，因此是一種行之有效的快速篩選方法。使用該方法，檢測結果≤200μg/kg的樣品，可判定為DSP陰性;而檢測結果＞200μg/kg的樣品應判定為DSP可疑陽性，顯示該水產品可能受到腹瀉性貝類毒素DSP的污染。

2.4 市場采樣樣品檢測結果

證明了磷酸酶抑制法是腹瀉性貝類毒素DSP的有效篩查方法之后，在市場上選購了22批次的貝類產品，使用TOXINLINE－DSP腹瀉性貝類毒素試劑盒進行檢測，檢測結果如表4所示。

表4 市場采樣貝類樣品檢測結果

表4結果顯示，經檢測，目前市售貝類水產品的DSP含量一般低于100μg/kg。由此可見，使用磷酸酶抑制法，以200μg/kg為陽性篩選檢出限，可以做到將大批量的樣品快速篩查，在盡可能短的時間內排除絕大部分的陰性樣品，并篩選出可能受到污染的可疑陽性樣品，送交有條件的實驗室用其他方法進行進一步確認，從而在最大范圍內節省檢測時間與人力成本，提高檢測效率。

3 結論

綜上所述，使用磷酸酶抑制法可以對樣品中是否含有腹瀉性貝類毒素(DSP)進行定性檢測，并可以對樣品中貝類毒素的大致含量進行測定。本方法檢測耗時較短(＜4h)，特異性、重復性較好。本文所提出的陽性篩選檢出限(200μg/kg)遠低于我國相關標準的規定(600μg/kg)，是一種較為理想的篩選方法，能滿足世博會等重大場合對食品安全保障的需求。值得指出的是，有研究表明，有些種類的貝類中可能含有某種成分能降低DSP的水解效率，使得本檢驗方法未必適合所有的貝類樣品［14］。此外，由于天然含腹瀉性貝類毒素DSP樣品不易獲得，缺乏由天然陽性樣品中得出的檢測數據，還需要在后期檢測過程中對本檢測方法進行完善與補充。

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Study on determination of diarrhetic shellfish poisoning(DSP) in shellfish by phosphatase inhibition method

HU Xue－lian，QU Qin－feng，GU Wen－jia
(Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233，China)

The application of phosphatase inhibition assay as a screening detecting method of diarrhetic shellfish poisoning(DSP)was studied.The principles of this method were explored and the threshold value for detection limit was determined in this study，as well as the standard solution，the artificially contaminated samples and the market－sell samples.The reproducibility of this method was also discussed.As a result，the method of phosphatase inhibition assay showed a high veracity and good reproducibility.The detection limit we reached(200μg/kg)was much lower than the set standard of relevant stipulate(600μg/kg).Therefore，the method of phosphatase inhibition assay is an ideal way to detect DSP in aquatic products.

diarrhetic shellfish poisoning(DSP);phosphatase inhibition assay;screening detecting method

TS207.3

A

1002－0306(2011)11－0437－04

2010－08－31

胡雪蓮(1981－)，女，碩士，工程師，研究方向:食品科學。