響應面法優化二氧化氯殺滅蛋殼大腸桿菌工藝研究

羅紅霞，任發政，郭慧媛，趙 磊，黃彥芳，汪長鋼，王 建

(1.北京農業職業學院食品與生物工程系，北京 102442; 2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

響應面法優化二氧化氯殺滅蛋殼大腸桿菌工藝研究

羅紅霞1，任發政2，郭慧媛2，趙 磊1，黃彥芳1，汪長鋼1，王 建1

(1.北京農業職業學院食品與生物工程系，北京 102442; 2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

利用Design Expert軟件，根據Box－Behnken設計(BBD)原理采用四因素三水平的響應面分析法，對二氧化氯殺滅鮮蛋蛋殼大腸桿菌的條件進行了研究，獲得了二次多元回歸模型。對模型進行手動優化，利用優化模型優化出十組殺菌工藝參數，并對工藝參數進行了驗證。

二氧化氯，大腸桿菌，雞蛋，響應面法，優化

響應面法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的實驗設計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法，廣泛應用于化學化工、生物工程、食品工業等方面。它與正交實驗設計法相比，具有實驗周期短、求得的回歸方程精度高、能研究幾種因素間交互作用等優點。本研究以雞蛋殼大腸桿菌殺菌量為評價指標，在二氧化氯濃度、pH、滅菌溫度和浸泡時間四個單因素預實驗的基礎上，利用響應面分析法優化二氧化氯殺滅蛋殼大腸桿菌的條件，為鮮蛋消毒劑的進一步開發和保潔蛋生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 同批新鮮柴雞蛋，采自北京農業職業學院養雞場;二氧化氯 食品級，山東兆冠化工集團公司;營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基 國藥集團化學試劑有限公司;大腸桿菌8099 北京農業職業學院食品與生物工程系食品檢測實驗室保藏。

精確電子天平;XSP－BM15顯微鏡;MVS－1漩渦混合器;100級潔凈工作臺;DHP－9272型電熱恒溫培養箱;移液槍;滅菌槍頭;手提式壓力蒸汽消毒器; HZQ－C空氣浴振蕩器;pH213臺式酸度離子計;菌落計數器;血球計數板;滅菌生理鹽水;滅菌蒸餾水;燒杯;L形玻棒;放大鏡等。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞蛋處理 將鮮雞蛋用自來水沖洗，除掉表面污物，瀝干后用75%酒精擦洗蛋殼，置超凈工作臺內紫外照射1h，中間翻轉一次，以達到蛋殼滅菌效果。

1.2.2 菌種制備和接菌 將大腸桿菌8099以無菌操作方式接入營養肉湯培養基，(37±1)℃振蕩培養12h，制備菌懸液。利用顯微鏡直接計數，將菌懸液稀釋至適當濃度(5×106cfu/mL以上)，然后分裝密封于10mL離心管中，放入4℃冰箱，備用。用移液槍以無菌操作方式取1mL菌懸液，注入含有9mL滅菌去離子水的離心管中，用漩渦混合器混勻，做成1∶10的稀釋液，如此反復，將菌懸液做多個梯度稀釋。取恰當稀釋度的菌液進行平板涂布，用移液槍取1mL注入營養瓊脂平板中，每個稀釋度平行涂三個板，以L形滅菌玻璃棒將菌懸液涂布于瓊脂表面，避免涂到平板邊緣，將平板正置直至培養基表面干燥，將平板翻轉，(37±1)℃培養45～48h，進行菌落計數，計算菌懸液活菌數。

表3 各因素方差分析表

以無菌操作方式用移液槍吸取1mL菌懸液，點接在滅菌雞蛋的蛋殼表面，在超凈工作臺內干燥30min，使菌體充分固定。

1.2.3 二氧化氯處理 將固定菌種的雞蛋浸入一定條件的ClO2溶液中，處理一段時間后，瀝干，用10mL滅菌蒸餾水將菌體洗下，制成菌懸液。將菌懸液以

1.2.2的方法做2～3個梯度的稀釋，并涂平板計數，計算活菌數。

1.2.4 殺菌量表示 殺菌量用活菌數的對數降低值表示，即－lgN/N0。其中，N0為起始活菌數;N為處理后活菌數，二者單位皆為cfu/mL。

1.2.5 響應面法實驗設計 在單因素預實驗基礎上，采用Design Expert7.0實驗設計軟件，利用響應面方法(RSM)中的Box－Behnken設計(BBD)，以溶液pH、ClO2濃度、滅菌溫度、浸泡時間4個因素為自變量，分別以X1、X2、X3和X4表示，每個因素取3個水平，以－1、0、+1編碼，以大腸桿菌殺菌量Y為響應值，進行實驗設計，實驗方案見表1。

表1 Box－Behnken設計因素水平表

2 結果與分析

2.1 蛋殼大腸桿菌殺菌量BBD設計實驗結果及響應面優化分析

按照Box－Behnken設計原理(BBD)的實驗方案進行四因素三水平實驗，實驗結果見表2。

表2 Box－Behnken設計實驗結果

利用Design Expert7.0軟件對所得數據進行回歸分析，得到多元二次回歸模型為∶

利用Design Expert7.0軟件的Box－Behnken模塊對方程進行手動優化，去掉部分不顯著項，得到多元二次回歸模型為∶

表4 優化殺菌參數的驗證

對模型(2)進行方差分析，結果見表3。

由表3可知∶一次項X1、X2和X4影響極顯著，X3影響顯著，二次項的影響極顯著，影響顯著;交互項X1X4影響顯著，X1X2影響不顯著。模型F= 164.07，P＜0.0001，說明回歸方程描述各因子與響應值之間的非線性方程關系是極顯著的，即這種實驗方法是可靠的。模型的復相關系數R2=0.9850，修正復相關系數R2Adj=0.9790，而預測復相關系數=0.9593，說明該模型能解釋97.90%響應值的變化，模型具有較好的回歸性;模型信噪比(Adeq Precision)為52.256，說明該模型具有足夠的信號來響應該設計，因而該模型擬合度良好，實驗誤差小，模型是合適的，可以對二氧化氯殺滅蛋殼大腸桿菌進行分析和預測。在所選取的因素水平范圍內，各因素對結果的影響排序為∶溶液pH＞浸泡時間＞ClO2濃度＞滅菌溫度。

分別將另外兩因素固定在0水平，對經手動優化后的回歸方程中的X1X2和X1X4交互項作響應曲面分析，見圖1、圖2。

圖1 溶液pH和二氧化氯濃度的交互影響

圖2 溶液pH和浸泡時間的交互影響

從圖1可以看出，在25℃、10min條件下，pH保持不變，隨著二氧化氯濃度增加，殺菌量逐漸增加;二氧化氯濃度不變，溶液pH在4～6的范圍內，殺菌力先增大后減小。

從圖2可以看出，在二氧化氯濃度為50mg/L、溫度25℃條件下，pH保持不變，隨著浸泡時間增加，殺菌量逐漸增加，且增加速度先快后慢;浸泡時間不變，溶液pH在4～6的范圍內，殺菌力先增大后減小。

從圖1、圖2兩個曲面看出，二氧化氯濃度和溶液pH交互作用不顯著;浸泡時間和溶液pH的交互作用較為顯著。

2.2 二氧化氯殺菌條件的優化

經過課題的前期研究發現，鮮蛋蛋殼大腸桿菌帶菌量指數一般不大于105cfu/g·mL，因此由回歸模型(2)來預測殺滅大腸桿菌的最優條件。

利用統計軟件Design Expert，優化出10組殺菌工藝參數，并根據參數進行實驗，結果見表4，大腸桿菌的死亡數量級均大于5，平均相對誤差為2.71%，證明響應面法優化二氧化氯殺滅蛋殼大腸桿菌的工藝是可行的。

3 結論

首次將響應面分析法(RSM)用于殺滅蛋殼大腸桿菌條件的優化，獲得良好的結果。獲得的優化回歸模型為

經響應面曲面法(RSM)優化出的殺滅5個數量級大腸桿菌的優化條件見表4，經檢驗證明10組殺菌參數均能達到殺菌效果。

利用該模型可以預測二氧化氯對雞蛋大腸桿菌的殺菌量。生產中，建議通過數學模型選擇合理的二氧化氯溶液濃度和處理時間，以確保得到理想的殺菌效果，并避免二氧化氯溶液濃度過高和處理時間過長對雞蛋品質產生影響。

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Optimum process of Escherichia coli of chlorine dioxide inactivation on eggshell by response surface methodology

LUO Hong－xia1，REN Fa－zheng2，GUO Hui－yuan2，ZHAO Lei1，HUANG Yan－fang1，WANG Chang－gang1，WANG Jian1
(1.Food Bioengineering Department，Beijing Vocational Agriucltural，Beijing 102442，China; 2.College of Food Science＆Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

By using Design Expert software，in accordance with theory of Box－Behnken design，the condition that Escherichia coli of eggshell of fresh eggs killed by chlorine dioxide as a response of four variables was researched.Then the fitted multivariate quadratic regress model was obtained.The model was optimized by manual operation.By utilizing optimization model，process parameters of ten groups were optimized.The process parameters were tested and verified.

chlorine dioxide;Escherichia coli;egg;response surface methodology;optimization

TS201.2

B

1002－0306(2011)11－0283－04

2010－08－23

羅紅霞(1962－)，女，教授，博士，研究方向:畜產食品科學。

國家科技支撐計劃子課題(2006BAD22B02);國家蛋品工程技術研究中心資助項目。