高山被孢霉發酵生產多不飽和脂肪酸的初步研究

張 靜，趙建新，陳海琴，陳 衛，張 灝

(江南大學食品學院，江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122)

高山被孢霉發酵生產多不飽和脂肪酸的初步研究

張 靜，趙建新，陳海琴，陳 衛，張 灝*

(江南大學食品學院，江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122)

高山被孢霉具有很強的脂肪合成能力，并可積累多種多不飽和脂肪酸，為進一步提高高山被孢霉多不飽和脂肪酸產量，對碳源、氮源等對高山被孢霉菌體生長和多不飽和脂肪酸(PUFA)生產的影響進行分析。研究結果表明:甘油可以作為葡萄糖的替代物用于高山被孢霉工業化發酵生產多不飽和脂肪酸;當脫脂豆粉與硝酸鉀的比例為2∶1時，此時菌體形態最利于脂肪酸生產，脂肪酸和花生四烯酸的產量分別為11.20g/L和5.89g/L，花生四烯酸的產量提高了4.0倍。

高山被孢霉，多不飽和脂肪酸，花生四烯酸

多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)指18碳以上含有兩個或兩個以上非共軛順式雙鍵的脂肪酸。主要包括亞油酸(LA)、α－亞麻酸(ALA)、γ－亞麻酸(GLA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。PUFA是生物膜的重要組成成分，可以調節細胞構型、相轉變及細胞膜的滲透性，同時是某些生物活性物質的前體，如類二十烷、前列腺素、白三烯等，具有重要生理功能［1－4］。高山被孢霉具有很強的多不飽和脂肪酸合成能力，尤其是花生四烯酸，在英國、日本等國已經實現工業化生產，而在我國尚處于起步階段，產量有待于進一步提高。高山被孢霉發酵生產多不飽和脂肪酸，其油脂存在于菌體內，產量受菌體生物量，菌體中脂肪酸的比例和高附加值脂肪酸如AA、GLA、EPA等在脂肪酸中的比例三方面的影響。在提高生物量的同時，不同菌體形態會對發酵液的狀況有很大影響，進而影響傳質傳氧。本研究希望通過接種方式、碳源、氮源、攪拌速率的研究改善菌體形態，促進發酵液中傳質傳氧，提高脂肪酸的產量，為具有我國自主知識產權的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高山被孢霉(Mortierella alpinaATCC 32222)購于美國標準生物品收藏中心，由本研究中心保藏;脫脂豆粉 青島隆海食品有限公司，低溫豆粕加工;大豆油 眾友食品科技有限公司;酵母粉 Becton，Dickinson and Company;聚氧硅烷 賽歐信越X－ 680;脂肪標準品 Nu－Chek公司。

氣相色譜GC－2010 Shimadzu Co.，Japan。

1.2 培養基與培養方法

1.2.1 培養基 斜面培養基∶PDA培養基;種子培養基(g/L)∶葡萄糖30，酵母粉5，KNO32，NaH2PO41，MgSO4·7H2O 0.3，pH 6.3，115℃滅菌20min。發酵基本培養基(g/L) 葡萄糖50，脫脂豆粉31，大豆油1，KH2PO43，Na2SO41，CaCl2·2H2O 0.5，MgCl2·6H2O 0.5，pH 6.0，115℃滅菌20min。

1.2.2 培養方法 菌種活化∶將孢子接種于PDA斜面，20℃于霉菌培養箱中培養14d以上。種子培養∶向斜面培養基加入9mL種子培養基，輕刮孢子，以4%的接種量接種于種子培養基中，20℃，200r/min培養3d(液體發酵在250mL三角瓶中進行，每瓶裝液量45mL)。將培養至3d的菌體用分散器打散成均勻的菌體片段，以1g/L菌體片段接種于種子培養基中，20℃，200r/min培養36h，作為發酵用菌種。發酵培養∶250mL搖瓶培養裝發酵培養基50mL，回轉式搖床轉速200r/min，溫度20℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 高山被孢霉菌體生物量的測定 全發酵液先用布氏漏斗真空抽濾分離發酵液和菌體，再用蒸餾水洗滌3遍，得到的菌體放入－80℃超低溫冰箱中過夜，然后進行冷凍干燥得到干菌體，冷凍干燥程序為∶首先以0.5℃/min由室溫降至－40℃，預凍40h，然后以0.15℃/min由－40℃升溫至－25℃并保持9h，再以 0.15℃/min由－25℃升溫至－10℃;繼而以0.3℃/min由－10℃升溫至25℃并保持4h，最后以0.5℃/min至室溫保持4h。每升發酵液中干菌體的重量即為菌體生物量。

1.3.2 高山被孢霉菌體中脂肪酸組成及含量的測定稱取(0.0600±0.0004)g高山被孢霉菌體，加入1mg/ mL的17∶1脂肪酸標準品200μL，采用B＆D法［5］提取粗脂質;在提取出的粗脂質中加入1mL 0.5mol/L KOH－MeOH溶液，70℃水浴30min，然后加入2mL 25%(v/v)BF3－MeOH溶液，70℃水浴20min進行脂肪酸甲酯化，水浴后加入正己烷2mL，飽和氯化鈉溶液4mL，分離得到脂肪酸甲酯溶液。脂肪酸甲酯分析采用氣相色譜 GC－2010，色譜柱為 DB－Waxetr (30m×0.32mm，0.25μm)。氫火焰離子檢測器檢測，汽化室和檢測器溫度分別為250℃和260℃，分流方式進樣1μL，分流比10∶1，載氣為氮氣。程序升溫∶初始溫度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以1℃/min升到210℃，保持15min。高山被孢霉中脂肪酸甲酯氣相色譜分離圖譜見圖1。

圖1 高山被孢霉中脂肪酸甲酯氣相色譜圖

1.3.3 其他測定 還原糖測定采用DNS法［6］;含氮量測定采用微量凱式定氮法GB/T 5009.5－2003。

2 結果與討論

2.1 高山被孢霉生長過程分析

高山被孢霉在發酵基本培養基中20℃、200r/min搖瓶培養168h，測定細胞生長曲線、脂肪酸生成曲線、殘糖和殘氮曲線，如圖2所示。高山被孢霉在整個培養過程中主要分為四個階段。第一階段(0～12h)，細胞生長處于延滯期，培養液中固態的脫脂豆粉逐漸水解為液態。第二階段(12～72h)，葡萄糖和脫脂豆粉大量消耗，菌體的生物量迅速增加，隨細胞生長單位菌體中脂肪酸含量增加并逐漸趨于穩定達13.8%。第三階段(72～120h)，發酵液中可利用氮源逐漸耗盡，葡萄糖消耗速率減緩由對數期的11g/L· d降至5g/L·d，菌體中脂肪酸的比例開始大幅度的增加。在氮源充足時轉化效率為11g脂肪酸/100g葡萄糖，當氮源缺乏時轉化效率達到18g脂肪酸/ 100g葡萄糖，因此氮源缺乏時葡萄糖可以更高效地用于脂積累，但與理論值32g脂肪酸/100g葡萄糖有一定的差距［7］。第四階段(144～168h)，發酵培養基中氮源和葡萄糖均已耗盡，生物量迅速減少。

2.2 不同培養時間下高山被孢霉單位菌體脂肪酸組成分析

很多微生物趨于以脂質形式貯存它們獲得的能量，因此有必要研究培養時間對高山被孢霉發酵生產的脂肪酸組成的影響。單位菌體中的脂肪酸組成情況見圖3，各種脂肪酸的產量隨菌體所處的生長階段的不同而發生改變。AA在不同的生長階段的脂積累情況為∶當氮源充足時，AA隨著細胞的生長緩慢的增加;當無可利用氮源時，細胞停止生長，AA隨FA的大幅度增加而大量積累，由最初的7.7%經過了7d的培養達到最大值25.9%，單位菌體中AA含量從培養的第4d開始大量增加的同時伴隨著主要是亞油酸含量的減少。EPA在不同生長階段的脂積累情況∶在整個生長階段EPA含量較低，在第4d達到最大值僅有0.637mg/g干菌體。硬脂酸和軟脂酸等飽和脂肪酸在氮源耗盡后在總脂肪酸中的比例開始大幅增加，在葡萄糖耗盡后降低。硬脂酸、軟脂酸等脂肪酸在第6～7d開始緩慢下降，其可能原因是培養基中無可利用的葡萄糖，菌體通過分解自身的部分脂肪酸來獲得生長所需要的能量。Ratledge等研究表明，當氮源充足時，葡萄糖進入三羧酸循環，產油微生物利用進行菌體生長，PUFA為初級代謝產物且產量與細胞生長相關，因此氮源充足時PUFA隨菌體生長在總脂肪酸中比例略有增加;當培養基中無可利用氮源時，產油微生物能夠將剩余的碳源都有效地轉化為了脂肪酰CoA，最終形成三酰甘油酯，從而可以解釋脂肪酸的大幅度增加［7］。2.3 接種量的確定

圖2 高山被孢霉的生長曲線

圖3 不同培養時間下高山被孢霉單位菌體中脂肪酸的組成情況

高山被孢霉產孢子量只能達到104，且存在孢子萌發情況不一的問題，為了使實驗結果可在合作方實驗室重現，需要建立高山被孢霉接種的標準化方法。因此我研究中心以菌體濕重作為接種量的衡量標準，建立了菌體打碎后定時生長、定量接種來實現菌種的標準化培養方法。在菌體打碎后，分別以1、2、4、6g/L菌體濕重接種于種子培養基，然后再以10%的接種量接種于發酵培養基，研究不同接種方式對于高山被孢霉菌體生長和產脂的影響，結果見表1。不同菌球直徑的菌體接種于發酵培養基，菌體生物量沒有顯著性差異，隨著接入菌球直徑的減小，AA產量增加。同時發酵過程中發現，接入小直徑菌球培養物的生長速率大于接入大菌球的培養物，隨培養的進行，培養菌體形態的差異性逐漸變小。可能的原因是，培養初期，由于只有菌球外部菌絲體具有生長的能力，因而小菌球的生長速率遠遠大于大菌球。培養過程中，菌絲體斷裂，形成新的生長點，而發酵培養基中營養豐富，后期培養物差異性逐漸變小。Higashiyama對于高山被孢霉的研究表明1～2mm菌球直徑的菌體最利于AA生產［8］。綜上，采用6g/L濕菌接種于種子培養基。

表1 不同接種量對高山被孢霉細胞生長和產脂的影響

2.4 不同碳源對高山被孢霉生長和產脂的影響

分別以5%的非糧食來源甘油和木糖作為唯一碳源，研究不溶碳源對菌體生長的影響。從表2中我們可以看出，葡萄糖為最佳碳源，同時高山被孢霉能很好地利用甘油進行脂積累，菌體生物量為31.6g/L，略低于葡萄糖的39.2g/L。在生物油脂的生產過程中會產生大量的粗甘油，粗甘油用于單細胞油脂生產可以直接進入提取步驟，而提取是單細胞油脂加工工藝中成本最高的一項［9］。因此，以甘油替代或部分替代葡萄糖作為高山被孢霉工業化生產的原料，將大大降低生產成本，這有待于進一步研究。

表2 不同碳源對高山被孢霉細胞生長和產脂的影響

2.5 復合氮源比例的確定

PUFA是胞內產物，在PUFA的商業化生產中提高PUFA產量需要提高菌體濃度。有機氮源脫脂豆粉有利于高山被孢霉細胞生長，但羽狀的菌絲體大大增加了發酵液的粘稠度，影響了氧和養分的傳遞和發酵液的均一性［10］。Jang等研究表明KNO3是用于AA和PUFA生產的最佳無機氮源，鉀離子有助于硝酸根的吸收［11］。因此，希望通過以無機氮源部分替代有機氮源來降低發酵液的粘稠度，同時可以降低生產成本。

由表3可知，通過改變脫脂豆粉和KNO3的比例，培養發現菌體形態、非脂生物量和脂肪酸組成有較大差異。隨KNO3比例的增加，菌絲體形態分別呈現羽狀、大的菌團，表面逐漸光滑的菌球。當有機氮源與無機氮源的比例為5∶1時，菌體形成一個大的菌團，生物量大幅度下降到25.6g/L，下降了32%，脂肪酸產量也隨之下降。其他不同氮源配比的高山被孢霉菌均形成小菌球，隨著KNO3比例的提高，發酵液的粘稠度降低，AA的含量增加。造成這種差異可能的原因是∶不同配比的氮源改變了菌體表面的電荷狀況從而造成菌體形態的差異。細胞壁電斥力和細胞聚集與分散水平有關系，在根霉［12］和釀酒酵母［13］的培養中已經發現。菌體形態的改變可影響菌體對于營養和氧的攝入，當菌球半徑超過一定的值時，密實菌球區域可能受到培養基的限制而抑制生長。Hamanaka等采用FITC異硫氰酸熒光素和尼羅紅對高山被孢霉菌球進行染色分析菌絲中脂質體的分布，發現菌絲內部中心為一空穴，而脂存在于菌球邊緣菌絲密集處［14］。中心的空腔是由于長期處于營養和氧氣匾乏狀態下死亡自溶而導致的。當菌體形態呈分散均勻的小球時，隨KNO3比例的增加每克非脂生物量所需要的豆粕粉的量減少，由此可見KNO3以適宜的比例替代豆粕粉有助于非脂生物量的提高。當有機氮源與無機氮源比例為2∶1時，脂肪酸產量、AA和 EPA大幅度提高分別為11.97、5.06g/L和38mg/L(表3)，分別提高了0.38、3.29和0.31倍。因此，當脫脂豆粉與KNO3比例為2∶1時有利于高山被孢霉脂肪酸的生產。

表3 不同氮源比例對高山被孢霉生物量和FA、AA和EPA產量的影響

表4 高山被孢霉各脂肪酸組成

2.6 攪拌速率的確定

高山被孢霉為好氧性絲狀真菌，在培養過程中需要通過攪拌槳來使氣體分散提供滿足細胞生長和產脂的需要，同時菌體在攪拌槳剪切力的作用下菌絲體斷裂，斷裂的菌絲體片段形成新的生長點繼續生長，因此不同的攪拌速率將形成不同的菌體形態，影響到細胞生長和脂肪酸的產量。本研究采用六直葉攪拌槳，去除擋板(菌絲體在發酵的過程中易附著在擋板上進行生長，故去除擋板)分別選取了100、200、300r/min三個攪拌速度進行研究。隨著發酵的進行，發酵液中細胞濃度不斷增加，在使用100r/min培養時，靠近發酵罐罐壁有大量菌體形成團狀，影響了發酵液中養料和氧的傳遞。當攪拌速率為200或300r/min時，菌體可以很好地分散成均勻的小球，為了減少攪拌過程中對菌體的傷害，選擇200r/min。

2.7 3L發酵罐批發酵放大實驗

在前期搖瓶培養的基礎上，采用3L發酵罐進行放大實驗，裝液量為1.5L，通氣量為0.5vvm，攪拌速率200r/min，采用自動消泡，消泡劑為聚氧硅烷。脫脂豆粉20g/L，KNO310 g/L，其他同基本培養基，經過6d發酵，菌體生物量為34.9g/L，FA和AA分別為11.20、5.89g/L，各脂肪酸組成見表4。

3 結論

本研究首先對高山被孢霉在基本發酵培養基中的生長特性進行了研究，氮源耗盡前后葡萄糖轉化為脂肪酸的效率分別為11%和18%。采用基本發酵培養基菌體形態為放射羽狀，菌體生物量達到39g/L，但發酵液粘稠度大，不利于傳質傳氧。研究采用6g濕菌體每升發酵液接種，KNO3替代脫脂豆粉1∶2(w/w)，200r/min的攪拌速率，發酵過程中的菌體形態為更利于傳質傳氧的毛絨小球，菌體生物量為34.9g/L，FA和AA分別為11.20、5.89g/L，其中AA產量提高了約4.0倍。

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The preliminary study of fermentation conditions for polyunsaturated fatty acids production by Mortierella aplina

ZHANG Jing，ZHAO Jian－xin，CHEN Hai－qin，CHEN Wei，ZHANG Hao*
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China)

Mortierella alpina yielded high amount of lipid and many kinds of fatty acids.To improve the production of polyunsaturated fatty acids，the effect of carbon source，nitrogen source on the polyunsaturated fatty acids(PUFA) contents of Mortierella alpina were studied.The results showed that glycerine could be used as a substitute for glucose for Mortierella alpina industrial production of PUFA.When the ratio of defatted soybean powder and KNO3reached 2∶1，it improved dry cell weight productivity and fatty acids contents in cell，fatty acids and AA productivity reached 11.20g/L and 5.89g/L，AA productivity increased by 4.0 times.

Mortierella alpina;polyunsaturated fatty acids;arachidonic acid

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0216－04

2010－10－18 *通訊聯系人

張靜(1985－)，女，碩士研究生，主要從事油脂微生物方面的研究。