一株細菌型豆豉發酵菌種的篩選及鑒定

李小永，陳 偉，程 芳，李 靖

(山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018)

一株細菌型豆豉發酵菌種的篩選及鑒定

李小永，陳 偉*，程 芳，李 靖

(山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018)

從臨沂細菌型豆豉中篩選出一株適于豆豉生產的高產蛋白酶菌種，并對此菌種進行鑒定。結果表明:采用酪蛋白平板初篩，制曲復篩，根據曲樣蛋白酶酶活以及游離態含量共選出5株優良菌株用于豆豉的制作，由成品豆豉的理化指標和感官評定認為D2號菌種發酵的豆豉風味好，滋味鮮美。結合生理生化和16S rDNA序列分析初步鑒定D2號菌種為枯草芽孢桿菌，該菌株來源于豆豉，屬于安全菌種，具有研究開發價值。

細菌型豆豉，分離，鑒定，16S rDNA

豆豉起源于我國，它是以黃豆和黑豆為原料，經微生物發酵而制成的傳統發酵食品，按制曲發酵時參與的主要微生物種類的不同，豆豉分為米曲霉型、根霉型、毛霉型、細菌型以及脈胞菌型五大類產品［1］，其中山東臨沂的八寶豆豉就是細菌型豆豉的典型代表，此外在云南、四川、貴州等省民間也有細菌型豆豉的制作。國外細菌型豆豉以日本的納豆最為出名，嚴格來說納豆源于我國細菌型豆豉，是我國細菌型豆豉的孿生姐妹。用蛋白酶產生菌進行豆豉的制作，微生物產生的胞外蛋白酶可直接作用于大豆蛋白，將大分子蛋白質水解成小分子肽類以及游離態氨基酸，這些物質不僅易為人體消化吸收，還具有很強的生物活性，并且對豆豉的風味也有很大的影響，這對功能性豆豉食品的研制十分有利，目前日本流行的功能性食品納豆就是利用納豆芽孢桿菌(Bacillus stubtilis natto)為主要發酵劑生產的，因該菌能產納豆激酶(Nattokinase，NK)，一種絲氨酸蛋白酶［2］，并且有很強的溶栓活性，受到了廣泛的關注，而我國細菌型豆豉還沒有明確的發酵菌種，這導致了我國細菌型豆豉的生產規模以及制作工藝都受到很大程度的限制。目前我國豆豉的生產仍是以傳統的自然發酵為主，由于菌種沒有明確的分離鑒定，尚未制作成發酵劑，另外在民間制作發酵過程中各項條件難以控制，存在著安全隱患［3］。結合以上問題，以臨沂八寶豆豉為原料，通過酪蛋白初篩，制曲復篩篩選出高產蛋白酶菌種，并進一步制作豆豉，篩選出適于豆豉生產的高產蛋白酶菌種，并對其進行生理生化鑒定，同時結合16S rDNA對該優良菌種進行鑒定，旨在篩選出適合豆豉生產的優良菌種。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

沂蒙特產八寶豆豉 臨沂惟一齋醬園生產，購于泰安銀座超市;黑豆 購買于泰安中百商城;干酪素、酪氨酸，DNA marker，瓊脂糖以及其它電泳試劑

均為生化試劑;細菌基因組DNA提取試劑盒 北京天跟公司;活化、保存菌種培養基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基;初篩培養基 酪蛋白瓊脂培養基［4］;產芽孢培養基［5］肉湯培養基100mL，玉米粉5g，酵母膏0.5～1g，pH 7.2～7.4。

1.2 實驗方法

1.2.1 細菌型豆豉中產蛋白酶菌種的初篩 無菌操作取25g豆豉加入到含有225mL無菌生理鹽水的搖瓶中，在搖床上200r/min分散10min，得到稀釋10倍的菌液，再依次用生理鹽水稀釋得到稀釋倍數為105～107的菌液。分別取稀釋倍數為105～107的菌液100μL均勻涂布于酪蛋白培養基上，每個稀釋度做三個重復。37℃培養48h后觀察有透明圈菌落的形態、挑取有透明圈的菌落并將其反復劃線于酪蛋白瓊脂平板培養基上，直至分離成單菌落后將菌種接種在牛肉膏蛋白胨固體斜面培養基上于4℃下保存。然后用梯度稀釋法將菌液涂布在酪蛋白培養基上面，37℃培養48h后測量透明圈直徑與菌落直徑的比值。

1.2.2 菌種活化 挑取一環斜面上面的菌種接種在活化液體培養基里，37℃搖瓶培養24h后保存在4℃。采用稀釋平板法計數。

1.2.3 細菌型豆豉中產蛋白酶菌種的復篩 將從市場購買的黑豆用三倍體積的水浸泡24h，將黑豆取出瀝干，將黑豆放于燒杯中，燒杯上包八層紗布，并用報紙包好，121℃滅菌25min，滅菌后，待黑豆溫度降至40℃左右后按每100g接種2mL 108cfu/mL的菌液量將菌液在無菌條件下接種于黑豆中，混勻。37℃培養，每24h測一次蛋白酶活性，連續測定96h，從中篩選出蛋白酶活性較高的菌株。

1.2.4 蛋白酶酶活的測定 粗酶液的制備∶取10g曲樣室溫下研磨，然后加入60mL磷酸緩沖液(pH7.5)洗滌，將洗滌液裝入 150mL三角瓶中，30℃，160r/min條件下搖床振蕩30min，然后用四層紗布過濾，濾液經抽濾后取5mL于50mL容量瓶中，用磷酸緩沖液定容搖勻，即為粗酶液。蛋白酶酶活的測定∶采用紫外分光光度法［6］。

1.2.5 氨基態氮的測定 采用甲醛滴定法測定［7］。

1.2.6 豆豉制作工藝［8］黑豆→清洗→浸泡→高壓蒸煮→冷卻→接種→制曲→洗曲→拌鹽后酵→干燥→豆豉

前處理以及制曲同1.2.1，制曲72h后洗曲加鹽10%于45℃后酵15d，50℃條件下干燥。

1.2.7 豆豉主要成分分析 水分、粗蛋白質、游離氨基態氮、總酸、脂肪以及灰分的測定參見文獻［9］。總氮用凱氏定氮法測定。

1.2.8 豆豉感官評定標準［10］根據豆豉的色、香、味、體設計相關的評定標準，對制作后的豆豉由10名食品學院研究生進行感官評定及打分，評定標準見表1。

表1 豆豉感官評定標準

1.2.9 菌種鑒定 菌體形態學和生理生化實驗∶菌體形態特征和生理生化特征參照文獻［11－13］中的方法。分子生物學(16S rDNA)鑒定∶細菌總DNA提取以及方法參考細菌基因組DNA提取試劑盒上面的說明進行。

16S rDNA的通用引物由上海博尚生物技術有限公司合成∶

上游引物 P1∶5'－AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT－3';

下游引物P2∶5'－TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC－3'。

PCR擴增的反應條件為∶95℃預變性5min，94℃變性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min 30s，進行35個循環，最后72℃保溫10min，反應后取5μL產物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。將PCR擴增產物純化后送華大測序公司進行測序。

測序結果在GenBank中注冊并通過Blast進行同源序列檢索，并用 MEGA5.0軟件采用鄰接法(Neighbor－Joining method)進行聚類分析和系統進化樹構建。重復取樣1000次進行自展值(bootstrap value)分析，以評估系統發育樹的置信度。

2 結果與分析

2.1 細菌型豆豉高產蛋白菌種的篩選

2.1.1 初篩結果 將梯度稀釋后的純菌種接種在酪蛋白培養基上面，37℃培養24h以觀察其透明圈大小，結果表明在接種的45株菌種中，共有30株形成可見的透明圈，根據透明圈直徑和菌落直徑比值的大小，共有10株透明圈直徑與菌落直徑比值大于3的菌種(表2)，選取該10株菌株進行復篩。

表2 高產蛋白酶菌株的初篩

2.1.2 復篩結果 對選取的10株菌種進行豆豉制曲復篩，每隔24h測定一次酶活以及游離態氮，連續測定4d，由圖1可以看出，在72h內各個菌種制曲產生的蛋白酶酶活隨制曲時間的延長除D1和D13號菌種外均顯著上升，其中72h的酶活除D1和D13號菌種外均處于最高水平，而96h時各個曲樣的蛋白酶酶活均顯著下降，該時期的曲樣略有氨味，說明該時期早已完成前發酵階段，若以該時期的曲樣進行豆豉制作，所得的產品味道發苦，醬香不足，氨味較濃。制曲期間菌種利用黑豆中的各種可溶性蛋白質及糖分進行繁殖，并產生蛋白酶及其它酶類，同時完成前發酵過程。各曲樣的游離態氮含量隨時間的延長均有增加的趨勢，并且都高于原料黑豆中游離態氮的含量0.24g/100g，說明菌種產生的胞外蛋白酶作用于黑豆的蛋白質并產生多肽或氨基酸，這些物質對豆豉的品質、風味以及營養影響較大，根據曲樣的蛋白酶酶活以及曲樣中游離態氮含量，分別選取在72h時酶活大于150U/g和游離態氮含量大于0.3g/100g的菌種，即選取D2、D8、D10、D16、D17號菌種進行豆豉制作。

表3 原料黑豆、純種發酵豆豉成品和市購八寶豆豉主要成分的比較

表4 豆豉感官評定打分

圖1 各曲樣不同時間內蛋白酶活力以及游離態氮含量變化

2.2 豆豉制作

2.2.1 豆豉各項成分測定 為了篩選出適于豆豉生產的菌種，分別對復篩中的5株菌種接種黑豆制作豆豉，因5個菌種在產孢培養基培養后進行芽孢染色均有芽孢產生，故這些菌種均為芽孢桿菌，故選取后酵溫度為45℃。表3給出了原料黑豆、純種發酵大豆以及市售八寶豆豉的各主要成分，從表中可以看出各個菌種發酵后的豆豉蛋白質含量均有下降，但是氨基態氮、總酸以及灰分均比原料有很大的提高，這與李華等［7］研究的相符。與市購八寶豆豉相比，由于原料以及發酵條件不同，蛋白質含量較市購八寶豆豉高，游離態氮以及其它指標均接近于市購八寶豆豉，并且各菌種發酵的豆豉均符合豆豉行業標準SB82－1980中的規定。

2.2.2 感官評定結果 對制作的細菌型豆豉進行感官評定(表4)，根據評定結果，D2號菌制作出來的豆豉具有細菌型豆豉特有的醬香，濃郁綿長，并且滋味鮮美、軟硬適中，為最優產品，對D2菌種進行鑒定。

2.3 菌種鑒定

2.3.1 D2菌體菌落描述 D2菌種在顯微鏡下觀察呈桿狀(圖2)，芽孢中生或端生，圓形或橢圓形，革蘭氏染色為陽性。在固體培養基24h培養后菌落直徑2.1mm左右(圖2)，圓形，乳白色，表面褶皺，無光澤，邊緣不整齊。試管液體中培養有菌膜，菌膜表面褶皺，無沉淀。

圖2 D2菌種在顯微鏡以及LB培養基中形態特征

2.3.2 生理生化特征 以枯草芽孢桿菌為參照菌種，對D2號菌種進行部分生理生化特征的測定以及糖發酵實驗，生理生化包括過氧化氫酶實驗、對氧需求、V－P測定、明膠液化、淀粉水解、吲哚實驗、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽實驗、葡萄糖產氣實驗;糖醇發酵包括葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇;并分別觀察在2%、5%、7%、10%NaCl含量條件下菌種的生長情況，結果表明D2號菌種與參照菌種的生理生化特征相似。參考文獻［3－5］中對枯草芽孢桿菌的描述以及生理生化特征，確定D2菌種為枯草芽孢桿菌。

2.3.3 菌株16S rDNA序列擴增 以菌株D2的基因組DNA為模板，PCR擴增后經電泳檢測得到一條大約1500bp的特異性條帶，與預期的基因片段大小一致，如圖3所示。

2.3.4 16S rDNA序列測定及分析 菌株 D2 16S rDNA序列擴增經測定，全長為 1436bp(登錄號∶

圖3 菌株16SrDNA PCR擴增結果

HQ221994)。將該序列通過BLAST進行同源序列檢索發現，在親緣關系相近的前100個序列中，99個為芽孢桿菌屬的菌株，其中同源性最高的前10個菌株中有7個為枯草芽孢桿菌，D2菌株與它們都具有99%以上的相似性。其中與Bacillus subtilis(登錄號∶GQ861470.1)的差異性最小，同源性水平最高。

根據16S rRNA序列同源性比對結果，選取來自核酸數據庫上有代表性的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、蘇云金芽孢桿菌 (B.thuringiensis)、巨大芽孢桿菌 (B.megaterium)、堅強芽孢桿菌(Bacillus firmu)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) 和 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 (Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)等9株芽孢桿菌的16S rDNA的序列與 D2菌種的16S rDNA序列以多粘類芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa，EU855214)作為一個單獨的外群種用鄰接法(Neighbor－Joining method)進行聚類分析和系統進化樹構建，結果見圖4，分支上的數據為1000次重復獲得的自展檢驗Boot strap值，由系統進化樹可知，D2菌種與枯草芽孢桿菌 B.subtilis(登錄號∶EU855214)落在同一分支，并且具有較高的自展值(boot strap value，100%)，與其它細菌均相距較遠，表明D2菌種與B.subtilis的親緣關系最近，結合該菌形態及生理生化特征初步判斷該菌株屬于枯草芽孢桿菌。

圖4 D2菌種系統發育樹狀關系圖(括號內為菌種的登錄號)

3 討論

豆豉的生產分為前酵(制曲)和后酵兩個階段，制曲階段主要是利用菌種產酶，后酵則主要是利用微生物和酶的作用提高產品風味和增強保藏性［14］。豆豉中微生物產生的蛋白酶使蛋白質分解成胨、多肽、氨基酸等，這些物質不僅可以賦予產品鮮味，而且還利于消化吸收、具有多種生理功能［3］，故以高產蛋白酶菌種接種黑豆進行豆豉制作，制作出的產品不但符合豆豉產品的最終要求，而且還具有多種功能性成分。

本研究通過對高產蛋白酶菌種的篩選，經豆豉制作，綜合豆豉理化指標以及感官評定篩選出一株優良菌種，并通對該菌種的生理生化以及分子檢測，初步認為該菌種為枯草芽孢桿菌。而枯草芽孢桿菌作為一種安全多功能、無毒、無害的菌種［15］，已被廣泛應用于食品以及醫藥衛生行業。

枯草芽孢桿菌能產生大量的淀粉酶和蛋白酶，是細菌型豆豉發酵過程中不可缺少的菌種［3］，目前用于豆豉發酵最多的是納豆的生產，是利用枯草芽孢桿菌的一個亞種納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)作為發酵菌種的日本細菌型豆豉。而我國細菌型豆豉的制作由于沒有明確菌體的菌種，生產過程及發酵均難以控制，并且還存在一定的安全隱患，故明確豆豉發酵菌種，并利用豆豉中優良菌種進行豆豉制作具有重要意義。

豆豉制曲期間游離態氮以及蛋白酶酶活隨著制曲時間的延長而增加，當蛋白酶酶活達到一定值時，曲樣的蛋白酶酶活開始下降。與其它芽孢桿菌相比，枯草芽孢桿菌更適合作為豆豉的發酵菌種。從豆豉中篩選高產蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌種，并純種制作出的豆豉，符合豆豉行業標準的要求。

4 結論

采用酪蛋白平板初篩，制曲復篩，選取D2、D8、D10、D16、D17號菌種進行豆豉制作，經測定5種成品豆豉的理化指標均符合豆豉行業標準的要求，綜合豆豉理化指標和感官評定認為D2號菌種蛋白酶產量高，發酵風味好。生理生化和16S rDNA序列分析結果鑒定該菌為枯草芽孢桿菌。菌株 D2 16S rDNA序列經測定，全長為 1436bp(登錄號∶HQ221994)，與Bacillus subtilis的差異性最小，同源性水平最高。該菌種源于豆豉，屬于安全菌種，具有開發利用價值。

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Screening and identification of a strain for lobster sauce fermentation

LI Xiao－yong，CHEN Wei*，CHENG Fang，LI Jing
(College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China)

A bacteria producing high protease and suiting for fermenting lobster sauce from bacteria lobster sauce of Lin Yi was screened and identified.The result showed that five high－yield strains of protease were screened by casein plate and re－screened by starter making.According to the enzyme activity and free nitrogen’s content of startor of lobster sauce，five superior strains were used to ferment lobster sauce respectively.According to the sensory tests，physical and chemical indexes of five products，the Lobster Sauce fermented by D2 strain had a good flavor and the product was very delicious.Combining physiological characters and the sequence analysis of 16S ribosomal DNA，the strain D2 was preliminarily identified as Bacillus subtilis.The strain from lobster sauce was safe，therefore it was worth further studying and developing.

bacteria lobster sauce;isolation;identification;16S ribosomal DNA

TS201.3

A

1002－0306(2011)11－0212－05

2010－10－28 *通訊聯系人

李小永(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:工業微生物發酵。