酶法水解紅豆粉特性的研究

李 楊，江連洲，*，劉 琪，齊寶坤，王勝男，王 梅

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱 150030)

酶法水解紅豆粉特性的研究

李 楊1，2，江連洲1，2，*，劉 琪1，齊寶坤1，王勝男1，王 梅1

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱 150030; 2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱 150030)

采用酶法提取紅豆蛋白，篩選出5種蛋白酶，確定所選用的堿性蛋白酶作為水解酶;得出堿性蛋白酶提取紅豆蛋白的最佳條件:pH為8.8，加酶量為3.5%，溫度為56℃，時間為3.5h，料液比為1∶6.8，經過驗證與對比實驗可知在最優酶解工藝條件下蛋白得率可達到73.34%。

酶法，紅豆蛋白，紅豆

紅豆(Phaseolus angularis)，菜豆屬，豆科，為一年生草本植物。紅豆，又稱為小豆、紅小豆、赤豆、赤小豆、飯豆、金豆［1］。紅豆原產于我國，根據相關文獻記載，紅豆的栽培和利用技術在我國已有2000多年的歷史。紅豆除有較高的營養價值外還有較高的藥用價值，《本草綱目》亦將紅豆列為“本經中品”，稱紅豆能“下水腫，排癰腫膿血，療寒熱熱中消渴，止泄痢，利小便，下腹脹滿，吐逆卒僻，治熱毒，散惡血，除煩滿，通氣，健脾胃，令人美食［2］。赤豆種子中含有豐富的營養物質，現代研究表明，每100g赤豆中約含蛋白質20.09g、脂肪0.59g、糖類58.59g、粗纖維4.99g、總膳食纖維23.59g及微量維生素［3－4］。此外，還含有三菇皂貳、植物奮醇、色素、無機鹽等有效成分，紅豆除直接食用外，主要用于提取蛋白質和淀粉。我國對紅豆蛋白的開發和利用很有限，隨著人民生活水平的提高和健康意識的加強，逐步開展對紅豆蛋白的研究，開發和利用紅豆蛋白資源，對于改善人們的膳食結構具有重要意義。由于酶制劑工業的發展，張強等［5］利用2709堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制備抗氧化肽并利用sephadexG－25、DEAE52纖維素分離純化玉米抗氧化肽，并用幾種不同的實驗體系研究其體外抗氧化活性。代卉等［6］研究了Alcalase水解小麥蛋白制備的肽的抗氧化活性。任海偉等［7］利用堿性蛋白酶與中性蛋白酶對黑豆蛋白進行酶解制備抗氧化肽。采用酶法水解蛋白質，不僅水解度(DH)容易控制，而且組成蛋白質的氨基酸不容易被破壞;此外由于蛋白酶具有底物特異性，采用不同蛋白酶水解蛋白質能釋放不同活性的酶解物［8－9］。酶法水解進程一般通過水解參數來控制，最主要的是溫度、水解時間、pH和酶與底物比(E/S)。水解時間與DH有關，水解時間越長，DH越高［10］。本文就酶法水解紅豆，選出了最佳用酶，并得出protest 6L酶提取紅豆蛋白的最佳參數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆 市售;protex 6L堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、AS1398中性蛋白酶 丹麥Novo公司。

粉粹機 上海精科實業有限公司;離心機 北京醫用離心機廠上海申鹿均質機廠;精密電動攪拌機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;電子分析天平 梅勒特－托利多儀器(上海)有限公司;pHS－25型酸度計 上海偉業儀器廠;電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠;HYP消化爐、半自動定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 紅豆→清理→研磨→水分調節→粉碎60目過篩→調節溫度和pH→加酶水解→滅菌→離心分離→殘渣→干燥→超微粉碎→定氮

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 原料基本成分的測定方法 粗蛋白含量的測定參照GB/T5009.5－ 2003;水分含量的測定參照GB/T5009.3－ 2003;粗脂肪含量的測定參照 GB/ T5009.6－ 2003;灰分的測定參照GB/T5009.4－ 2003;淀粉含量測定參照GB/T5009.9－2003。

1.2.2.2 蛋白得率的計算公式 總蛋白提取率(%) =(大豆含總蛋白質量－酶解提取后殘渣含蛋白質量)/大豆含總蛋白質量×100%

1.2.3 protex 6L酶提取紅豆肽的單因素實驗

1.2.3.1 pH對紅豆蛋白得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于5個四頸瓶中，按1∶7固液比加蒸餾水浸泡，調節pH分別為7、8、9、10、11，溫度60℃，加入1.5mLprotest 6L酶，攪拌浸取3.5h，溶液離心30min(4000r/min)，沉淀干燥后稱量，沉淀超微粉碎，消化及定氮。

1.2.3.2 酶用量對紅豆蛋白得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于5個四頸瓶中，按1∶7固液比加蒸餾水浸泡，調節pH至8.5，保持溫度60℃，分別加入0.5、1、1.5、2、2.5 protest 6L酶，其余操作同1.2.3.1。

1.2.3.3 料液比對紅豆肽得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于5個四頸瓶中，分別按1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8固液比加蒸餾水浸泡，調節pH至9，溫度60℃，加入1.5mLprotest 6L酶，其余操作同1.2.3.1。

1.2.3.4 溫度對紅豆蛋白得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于5個四頸瓶中，按1∶7固液比加蒸餾水浸泡，調節pH至9，分別保持溫度50、55、60、65、70℃，加入1.5mLprotest 6L酶，其余操作同1.2.3.1。

1.2.3.5 酶反應時間對紅豆蛋白得率的影響 紅豆烘干碾磨60目過篩，分別稱取50g紅豆粉置于7個四頸瓶中，按1∶7固液比加蒸餾水浸泡，調節pH至9，溫度60℃，加入1.5mLprotest 6L酶，分別攪拌浸取2、2.5、3、3.5、4、4.5、5h，溶液離心30min(4000r/min)，沉淀干燥后稱量，沉淀超微粉碎，消化及定氮。

1.2.4 酶解工藝的響應面優化實驗 在單因素研究的基礎上，選取酶解pH、加酶量、料液比、酶解溫度和酶解時間5個因素為自變量，以蛋白得率為響應值，根據中心組合設計原理，設計響應面分析實驗，其因素水平編碼表見表1。

表1 響應面優化實驗因素水平編碼表

2 結果與分析

2.1 原料的基本成分

表2 紅豆主要成分(%)

2.2 酶制劑的篩選

利用1.2.1方法，采用5種不同的酶制劑進行酶解其結果見圖1。由圖1結果可以看出，堿性蛋白酶優勢最大，所以本實驗選擇堿性蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶制劑對蛋白得率的影響

2.3 堿性蛋白酶提取大豆蛋白的單因素實驗

圖2 各單因素對蛋白得率的影響

由圖2(A)結果可以看出，當加酶量大于3%時蛋白得率明顯增加，響應面實驗設計中加酶量水平選擇2%～4%。由圖2(B)結果可以看出，酶解溫度在60℃附近蛋白得率有較大值出現，考慮到交互作用，所以響應面實驗設計中酶解溫度選擇在50～70℃。由圖2(C)結果可以看出，酶解時間大于3h蛋白得率明顯增加，但當酶解時間大于4h，蛋白得率無明顯變化，響應面實驗設計中酶解時間選擇3～4h。由圖2(D)結果可以看出，料液比在1∶6處蛋白得率達到最大值，響應面實驗設計中料液比選擇1∶6～1∶8。由圖2(E)結果可以看出，pH在8.5～9.5附近有較大值出現，響應面實驗設計中pH選擇8～10。

2.4 響應面實驗設計及結果

本實驗應用響應面優化法進行過程優化。以x1、x2、x3、x4、x5為自變量，以蛋白得率為響應值y，響應面實驗方案及結果見表3。實驗號1～26為析因實驗，27～36為10個中心實驗，用以估計實驗誤差。

表3 響應面實驗設計及結果

通過統計分析軟件SAS9.1進行數據分析，建立二次響應面回歸模型如下∶

回歸分析與方差分析結果見表4，響應面尋優結果見表5，降維分析見圖3，交互相顯著的響應面分析見圖4。

表4 回歸與方差分析結果

由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著(P＜0.0001)，失擬項不顯著并且該模型R2=92.39%，R2Adj=82.24%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F檢驗可以得到各因素貢獻率為x4＞x2＞x1＞x5＞x3，即酶解時間＞加酶量＞pH＞料液比＞酶解溫度。由圖3可以看出各因素對考察指標蛋白得率的影響規律。

表5 響應面尋優結果

應用響應面優化分析方法對回歸模型進行分析，尋找最優響應結果見表5，由表5可知，當酶解pH為8.8，加酶量為3.5%，溫度為56℃，時間為3.5h，料液比為1∶6.8，響應面有最優值為73.34%±0.99%。

由圖3各酶解參數對蛋白得率的降維分析可知，蛋白得率隨酶解pH的增加先增加后減小，在pH為8.8時蛋白得率達到最大值;蛋白得率隨加酶量的增加而增加，但當蛋白得率達到最大值時將不再增加，而繼續增加加酶量會增加生產成本;蛋白得率隨酶解溫度變化先增加后減小，這說明堿性蛋白酶在酶解蛋白質的時候受溫度影響;蛋白得率隨酶解時間的增加而增加，但達到一定時間后蛋白得率將不再增大;蛋白得率隨料液比的增加而增大，但達到一定值后繼續增加料液比會稀釋底物濃度，所以蛋白得率減小。

圖3 各因素對考察指標的降維分析圖

由圖4的分析結果可明顯看出pH(x1)與酶解溫度(x3)、pH(x1)與酶解時間(x4)、酶解時間(x4)與料液比(x5)的交互作用對多肽得率的影響。由此可知酶解pH和酶解時間與其他因素的交互作用對水解度地影響較大。

圖4 各酶解參數對總蛋白提取率的降維分析

2.5 驗證實驗

在響應面分析法求得的最佳條件下，即酶解pH為8.8，加酶量為3.5%，溫度為56℃，時間為3.5h，料液比為6.8條件下進行3次平行實驗，蛋白得率3次平行實驗的平均值為73.34%。蛋白得率預測值為73.1%±0.99%。說明響應面分析的實驗結果與回歸方程預測值吻合良好。

3 結論

利用響應面分析方法對水酶法提取大豆蛋白的酶解工藝參數進行了優化。建立了相應的數學模型為以后的中試以及工業化生產提供理論基礎，并且得到了最優酶解工藝條件為酶解 pH8.8、加酶量3.5%、酶解溫度56℃、酶解時間3.5h、料液比1∶6.8。經過驗證與對比實驗可知在最優酶解工藝條件下蛋白得率可達到73.34%。

［1］余文慧.食藥兼優赤小豆［J］.藥膳食療，2004:43.

［2］韓濤，孫獻軍，李麗萍，等.紅小豆蛋白與淀粉的提取和分離初探團［J］.食品工業科技，1997(5):41－43.

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［10］Meng G T，Ma C Y.Fourier－transform infrared spectroscopic study of globulin from Phaseolus angularis［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2001，29: 287－294.

Study on the enzymatic hydrolysis of protein from red bean

LI Yang1，2，JIANG Lian－zhou1，2，*，LIU Qi1，QI Bao－kun1，WANG Sheng－Nan1，WANG Mei1
(1.Food College，North East Agriculture University，Harbin 150030，China; 2.Soy Bean Engineering Technique Research Center，Harbin 150030，China)

The aqueous enzymatic process of red beans protein from red beans was introduced.An alkaline proteinase had been screened from 5 proteinases.The optimal condition for red bean protein extraction by alkaline proteinase was 3.5%proteinase，reaction at 56℃，3.5h of hydrolysis，1∶6.8 of material and water ratio，and pH 8.8.The total protein extraction rate reached 73.34%under this optimal condition.

enzymatic hydrolysis method;red bean protein;red bean

TS210.1

A

1002－0306(2011)11－0177－04

2011－08－22 *通訊聯系人

李楊(1981－)，男，研究生，講師，研究方向:糧油加工。