脂肪酶和青霉素酰化酶催化合成手性化合物的研究進展

薛 屏，曹雪榮

（寧夏大學能源化重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

進展與述評

脂肪酶和青霉素酰化酶催化合成手性化合物的研究進展

薛 屏，曹雪榮

（寧夏大學能源化重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

生物酶催化合成手性藥物和中間體具有高效、節能和環境友好等突出的優勢，本文從提高催化反應效率的角度，評述了非水相酶催化反應的溶劑效應——溶劑體系對酶的活性和對映選擇性的調控作用；介紹了動力學控制合成β-內酰胺類抗生素的不同溶劑體系，包括有機物-水共溶劑體系、有機物-水不共溶劑體系、反膠束體系和雙水相體系。提出利用溶劑效應調控動力學合成體系，會有效提高酶催化合成 β-內酰胺類抗生素的產率和合成與水解比S/H值，從而實現底物的有效利用。

溶劑效應；脂肪酶；青霉素G酰化酶；手性化合物；對映選擇性

隨著對不同光學異構體藥物藥理作用研究的進展及對消旋藥物申報和使用的種種限制，手性藥物的研究和開發已經成為國際新藥研究的方向。目前世界上正在開發的1200種藥中，有820種屬于手性藥物，即2/3是手性的，預計2010年單一對映體的市場將達到2500億美元，由此而來的手性化合物合成方法就成了手性藥物能不能商品化生產的關鍵[1-2]。發展新型、高對映選擇性、高效的手性化合物合成方法成了許多科學家和企業家關注的焦點，其中生物酶催化由于溫和的反應條件及高度的選擇性而備受重視。

長期以來，普遍認為生物酶只能在水溶液中使用，而有機溶劑則是酶的變性劑，使得酶在有機介質中催化作用的研究進展十分緩慢。直到Klibanov等[3]發現酶在有機相中具有極高的熱穩定性和催化活性之后，酶用于有機介質中手性化合物的拆分與合成的研究漸成熱點。已報道的適于有機介質中的酶類有脂肪酶、酯酶、青霉素酰化酶、蛋白酶、過氧化物酶、醛縮酶多酚氧化酶、醇脫氫酶等，涉及手性化合物的拆分與合成反應有水解、酯化、環氧化、脫氫、開環等反應。目前大量的研究結果表明，酶催化合成手性藥物及中間體的產率和光學純度與反應溶劑的選擇密切相關[4-5]。溶劑對酶催化的活性和對映選擇性均有相當的影響，顯現出突出的溶劑效應。本文重點介紹了脂肪酶和青霉素酰化酶合成手性藥物和中間體催化反應的溶劑體系，對利用溶劑效應調控酶催化反應的選擇性的發展進行了評述。

1 有機溶劑對脂肪酶催化性能的影響

1.1 有機溶劑對脂肪酶活性的影響

酶在生命體內能夠催化許多化學反應，酶催化反應在水溶液中進行，被認為部分水分子與酶緊緊結合形成了水化層，水分子直接或間接地通過氫鍵、疏水鍵、靜電作用、范德華力等維持著酶分子的催化活性構象，這一部分水稱為“必需水”[6]。Klibanov等[7]考察了3種氧化還原酶，發現水含量在1000個水分子/酶分子，即在酶表面上有一個水單層時，酶的活性達到了最高。催化反應在非水溶劑中進行，大致可歸結為幾方面的優勢：一是增大了疏水性底物的溶解性；二是促進水中不利的反應和抑制水誘發的副產物；三是有利于產物和不溶性生物催化劑的回收再使用。然而，在多數情況下酶在有機介質中的活性比水中的低。大量的研究結果表明，酶在有機溶劑中的活性主要取決于水活度、底物與產物的溶劑化作用和溶劑的性質。

酶在有機溶劑中的催化活性與有機溶劑的親水性呈負相關性，酶通常在疏水性溶劑中比在親水溶劑中具有更高的活性。Laane等[8]用溶劑的極性參數lgP（P為某溶劑在正辛醇和水雙相體系中的分配系數）描述了溶劑的極性與酶活性的關系，并通過實驗得出規律：酶在 lgP＜2的極性溶劑中活性較低；在 2＜lgP＜4的溶劑中具有中等活性；在lgP＞4的非極性溶劑中具有較高的活性。Hernandez等[9]的實驗結果展現了在非極性溶劑正庚烷、正己烷和甲苯中，脂肪酶的活性是水相中活性的70%，但在極性溶劑異丙醇和乙醇中，相對于水相中的活性均低于40%。Frings等[10]利用脂肪酶在極性有機溶劑中拆分（R,S）-1-苯乙醇，酶幾乎無活性，溶劑極性降低，酶的活性增加。朱潔等[11]利用脂肪酶催化不對稱酰化反應拆分外消旋（R,S）-2-辛醇，考察了15種溶劑對脂肪酶活性的影響。研究結果表明，在強親水性溶劑二甲基甲酰胺和甲醇（lgP＜1）中，酶幾乎不表現出催化活性；在中等極性甲苯和苯（2＜ lgP＜3）中，酶具有中等活性，而在強疏水性溶劑正己烷和正庚烷（lgP＞3）中，酶表現出較高的活性。但劉軍民等[12]用固定化脂肪酶催化酮基布洛芬與丙醇酯化反應，發現在異辛烷（lgP= 4.7）中反應，固定化脂肪酶的活性卻比在環己烷（lgP=3.2）中的小，與Laane提出的規律不相一致，這可能是由于底物在異辛烷中的溶解度較小所致。

親水性溶劑趨向于奪取酶維持活性構象的“必需水”，導致酶的活性下降。在有機溶劑中失去“必需水”的酶，其構象或形態是否發生了變化? Yennawar等[13]由X射線晶體衍射測定了胰凝乳蛋白酶在正己烷中的交聯酶晶體結構，酶的三維結構與水相中比較沒有明顯的差異。盡管證實了酶在純有機溶劑中結構不變，但是，由于酶分子表面含有大量帶電基團和極性基團，在完全無水的情況下，這些帶電基團相互作用，使酶分子出于無活性的“鎖定”狀態，也很難發揮出高的催化作用。

關于酶的活性與存在于反應介質中水相關聯，目前更精確的方法是用熱力學水活度（αw）來表示介質中的水。水活度通過式子αw=Χw·γw與水的摩爾分數（Χw）和水活度系數（γw）相關聯。在一級近似范圍，水活度系數作為溶劑疏水性的函數而增高，其結果是，較低水濃度時，在疏水介質中比親水介質中更能提到一定值的αw，這樣，同一種酶在疏水溶劑中比在親水溶劑中所需要的水要少，而最適系統含水量隨著溶劑lgP的增大而減小。在脂肪酶催化丁酸與丁醇的酯合成反應中，在不同溶劑中反應速度的最高值不同，而達到最大值時溶劑中的含量也不相同，但達到最大值時最適水活度卻基本相同，均在0.5～0.6之間（圖1）[14]，反映出最適水活度不受溶劑的影響。

圖1 不同溶劑中水活度對催化酯合成活力的影響

有機溶劑替代結合水直接作用于酶的微環境水化層，剝去了酶“必需水”層從而影響酶的催化活性之外 ，溶劑對酶活性影響的另一種方式是溶劑通過對底物或產物擴散產生影響而制約酶的活性。溶劑疏水性的強弱直接影響底物和產物在溶劑相和酶環境中的分配，疏水性強的溶劑雖然有利于維持酶的微環境，但其與疏水性的底物之間的作用力不利于底物從溶劑相擴散到酶微環境中，同樣會導致酶活力的下降。這樣，采用單一組分的溶劑催化反應很難達到理想的效果，因此需要構筑新的反應體系。許建和等[15]在固定化脂肪酶催化酮洛芬的酯化反應中使用了由異辛烷作主溶劑，甲苯為助溶劑的混合溶劑體系。崔玉敏等[16]在固定化酶催化奈普生的酯化反應中采用了異辛烷作主溶劑，四氯化碳為助溶劑的混合溶劑體系，都取得了比較好的實驗結果。在混合溶劑系統中，所選溶劑的極性、配比要適當，原則上應兼顧酶的活性和底物的溶解性兩個方面，底物在混合溶劑中要有一定的溶解度而酶要有較高的活性。此外，在多數情況下，酶不溶于有機溶劑，酶在溶劑中分散性低，酶-酶堆積對酶-底物間相互作用會產生阻礙，不利于底物接近每一個酶分子，結果導致酶的催化效率低。

1.2 有機溶劑對脂肪酶選擇性的影響

酶高度的對映選擇性和立體選擇性，應用于手性藥物和中間體的催化合成，可謂酶催化工藝最為突出的優勢。在水溶液中進行酶催化反應，水的理化性質穩定，所提供的催化環境與酶在生物體內的接近，酶的對映選擇性幾乎固定不變。然而，由于許多有機底物的水溶性有限，需要在有機物-水共溶劑或有機溶劑中進行反應。但是，酶催化反應選擇性能夠被所用的有機溶劑（甚至在有機物-水共溶劑）的性質所影響，有時甚至影響非常顯著。溶劑體系的不同，酶催化反應呈現出不同的對映選擇性。作者以乙酸乙烯酯作酰化試劑[17]，利用固定化假單胞菌脂肪酶（PSL/HOOC-MCF）在甲苯溶劑中拆分外消旋（R,S）-1-苯乙醇（表1），40 ℃下反應48 h，底物（R,S）-1-苯乙醇的轉化率為50%，達到拆分反應的最大理論轉化率，單一對映體（S）-1-苯乙醇對映體過量值（eeS）和（R）-乙酸苯乙酯對映體過量值（eeP）分別達到99%；當反應溶劑為正已烷時，eeP值下降為 96%，而 eeS值仍然保持為99%，說明在正已烷溶劑中除了（R）-1-苯乙醇發生反應外，少量的（S）-1-苯乙醇也發生了反應生成（S）-乙酸苯乙酯。

表1 溶劑對固定化脂肪酶PSL/HOOC-MCF對映選擇性的影響

利用豬肝酯酶（PLE）催化內消旋環己烯二酯不對稱水解反應生成半酯（圖2）[18]，介質磷酸鹽緩沖溶液中加入二甲基亞砜、二甲基甲酰胺或叔丁醇時，水解反應的對映選擇性均有所提高，但反應速率下降。從純磷酸鹽緩沖溶液改為加入10%（體積比）叔丁醇-緩沖溶液后，對映體過量值ee從55 %提高到96 %。

從目前的研究結果看，有機溶劑對酶對映選擇性的影響是一個普遍的現象。目前，對于一個特定的酶催化反應，通過選擇反應最適宜的有機溶劑，能夠獲得光學純度高的單一手性對映體，布洛芬等外消旋化合物酶催化的適宜溶劑體系如表3。

圖2 脂肪酶PLE催化環己烯二酯不對稱水解反應

表2 溶劑對豬肝酯酶催化的環己烯二酯不對稱水解反應影響

表3 脂肪酶催化幾種外消旋體酯化反應適宜的有機溶劑[18]

在有些情況中，有機溶劑還影響了酶的立體選擇性，出現了對映選擇性倒轉的現象。米曲霉蛋白酶在催化N-乙酰丙氨酸氯乙酯與丙醇轉酯化反應（圖3），當溶劑從乙腈改為四氯化碳時，對映體偏向從 L-對映體變到 D-對映體[20]。假單胞菌脂肪酶在環己烷中催化潛手性二氫吡啶二羧基酯類衍生物水解產生R構型的產物，但是在異丙醚中該反應的產物為S構型[21]。

圖3 脂肪酶催化潛手性二氫吡啶二羧基酯類衍生物選擇性水解反應

2 酶催化合成β-內酰胺類抗生素的溶劑體系

β-內酰胺類抗生素主要分為青霉素類和頭孢菌素類，二者約占全部抗生素年產量的75%以上。化學法合成抗生素步驟繁瑣、條件苛刻，并且產生大量的三廢。而酶法具有工藝簡捷、條件溫和、催化效率和選擇性高等優點，同時省去了吡啶等毒性物質的使用，體現了低碳和綠色工藝技術[22-23]。青霉素G酰化酶（EC 3.5.1.11，PGA）在半合成β-內酰胺類抗生素產業中發揮著十分重要的作用，它既能夠催化水解青霉素G產生6-氨基青霉烷酸，又能夠催化合成各種不同的半合成青霉素和半合成頭孢霉素，因而產生了巨大的經濟效益[24-26]。在半合成β-內酰胺抗生素體系中，PGA催化的縮合過程可分為熱力學控制和動力學控制。熱力學控制的反應是水解反應的逆過程，酶僅用于加快達到平衡的速度，但不影響達到平衡時底物和產物的濃度。動力學控制的縮合反應中，PGA將母核與酰基供體結合形成目標產物半合成抗生素，起著轉移酶的功能；但同時也催化產物和酰基供體的水解反應，產物的合成速率與水解速率之比（S/H）成為衡量反應體系重要的經濟指標[27]。如青霉素G酰化酶催化7-氨基脫乙酰頭飽烷酸（7-ADCA）和 D-苯甘氨酸甲酯（D-PGM）合成頭孢氨芐體系（圖4），PGA可催化7-ADCA 與D-PGM發生縮合反應生成頭孢氨芐，也可催化頭孢氨芐和D-PGM發生水解反應，生成副產物 D-苯甘氨酸（D-PG），存在著頭孢氨芐合成與D-苯甘氨酸甲酯水解反應的競爭，產物最終的收率取決于合成速率和水解速率的相對程度，即合成與水解比 S/H。為了抑制水解反應速率，應選擇在有機溶劑或有機化物-緩沖溶液中進行酶催化合成反應。

2.1 有機物-水溶劑體系

2.1.1 有機物-水共溶劑體系

甲醇和甘油等親水性有機化合物與緩沖溶液能夠互溶，形成有機物-緩沖溶液共溶劑體系。Kim等[28]在合成匹氨西林水相體系中，分別加入親水性有機溶劑二甲基亞砜、甲醇、乙醇、乙腈，在 2%（體積比）的有機物-緩沖液共溶劑體系中進行反應，發現緩沖溶液中添加少量有機物，PGA的水解活性比合成活性均出現降低，但水解活性下降的幅度要高于合成活性，這意味著通過溶劑的調整可以在一定程度上調控合成反應與水解反應的相對速率。在氨芐西林合成的體系中加入醇類有機物[29-30]，在含有乙二醇、丙三醇和1,3-丁二醇的緩沖共溶劑中，酶能夠保持良好的活性，氨芐西林產率均較水相中反應有不同程度的提高，但合成速率均有所降低。Chow等[31]選擇在甲醇-水和乙二醇-水共溶劑中合成阿莫西林，發現在甲醇-水共溶劑中合成與水解比S/H值高于乙二醇-水中。作者利用合成的親水性聚合物磁性載體在水相中制備固定化PGA[32]，固定化酶在乙二醇中合成氨芐西林的產率為96.7%，合成與水解比S/H值為 1.60，產率和S/H值均明顯高于在緩沖溶液中進行的反應。實驗也得到，在同等的反應條件下，固定化 PGA催化進行反應，產率和合成/水解比 S/H值均高于游離酶。Aguirre等[33]在醇類-緩沖溶液溶劑中合成頭孢氨芐（表4），在 50%（體積比）乙二醇-緩沖溶液中，大幅度地提高了反應的合成/水解比，S/H值達1.351，是水相中的 2.4倍，頭孢氨芐的產率為64.1%。有機物-水共溶劑體系中通過水活度的降低，能夠有效地抑制產物和底物的水解，導致頭孢氨芐的產率提高。但在抑制水解反應進行的同時，合成速率也在降低，如在 50% 在有機物-水共溶劑體系中，合成速率為0.350 mmol/(L?min)，而在水相中的合成為0.932 mmol/(L?min)，這可能是由于親水性有機物易奪取酶表面的“必需水”，抑制了酶的活性。2.1.2 有機物-水不共溶劑體系

圖4 青霉素G酰化酶催化合成頭孢氨芐

表4 有機/水共溶劑對產率和S/H值的影響

水相中添加疏水性有機溶劑，會形成有機物-水不共溶劑體系。受底物在水中或親水性有機物-水共溶劑體系的不溶性所限，人們嘗試以有機物-水不共溶劑作酶催化反應的溶劑。Park等[34]在乙酸乙酯-緩沖液（30%，體積比）和四氯化碳-緩沖液（30%，體積比）中合成頭孢唑林，產率較在磷酸鹽緩沖溶液中分別提高了65%和56%。合成頭孢唑林的母核是 7-苯乙酰胺基-3-氯甲基頭孢烷酸對甲氧卞酯，酰基供體為4-氮唑-1-乙酸甲酯，二者疏水性強，在疏水性乙酸乙酯和四氯化碳溶劑中能夠溶解，這樣在反應過程中底物分子容易與酶活性中心接觸，有利于酶催化反應進行；同時有機物分子的存在對水解反應產生了抑制作用，總的結果導致合成頭孢唑林產量提高（表5）。

表5 頭孢唑林在有機物-水不共溶溶劑中的酶催化合成

有機溶劑引入到水相中具有增加底物的溶解度、抑制水解反應、控制酶的選擇性以及從低沸點的有機溶劑中易于回收產物等優勢。但是有機溶劑對酶活性和穩定性不可避免的存在一些負面影響。在PGA催化合成匹氨西林的有機物-水不共溶劑體系的實驗中得到，在添加環狀脂肪族（環己醇，環己酮），雜環脂肪族（二氧六環，四氫呋喃）和芳烴類（吡啶，酚）的緩沖溶液中，酶的活性很低，在這些有機物-水不共溶溶劑進行反應，匹氨西林的合成速率遠低于水相[28]，其原因很可能是溶劑分子與酶疏水性活性中心之間的相互作用使得酶不能發揮催化作用。有機物-水不共溶劑體系有利于疏水性底物的溶解、水活度的降低，但疏水性溶劑與酶之間的疏水性相互作用導致酶部分失活亦不容忽視。

2.2 反膠束體系和雙水相體系

在有機物-水溶劑體系中合成β-內酰胺類抗生素，在一定程度上能夠抑制產物和底物的水解。但有機溶劑對酶活性的影響導致反應速率降低，這對于工業化生產是不利的，建立可控制水解但對酶活影響小的新合成體系是值得研究探索的課題。

反膠束體系是表面活性劑分子在非極性溶劑中自發形成納米級的與正常膠束結構相反的一種油包水膠體分散系[35]。在反膠束中，表面活性劑分子在界面上定向排列，碳氫鏈伸向有機相；極性頭或荷電頭部及抗衡離子則向內排列，形成極性核，水可溶解到極性核中形成一個納米級的“水池”[36-37]。由于反膠束體系能夠較好地模擬酶的天然環境，因而，大多數酶在其中能夠保持活性和穩定性，甚至表現出超活性。利用 AOT/異辛烷反膠束體系進行酶法合成頭孢氨芐研究中發現，側鏈D-苯甘氨酸甲酯的水解明顯受到抑制，這可能是因為反膠束中的水被表面活性劑的極性頭束縛住而使水活度大大降低的緣故。

雙水相體系是利用兩種不同高聚物的水溶液或一種高聚物和一種無機鹽的水溶液，因其濃度不同而形成互不相溶的兩液相體系。不同物質進入雙水相體系后，由于表面性質、電荷作用和各種作用力如氫鍵和離子鍵等的存在和環境的影響不同，在兩相間的分配則不同。調整雙水相體系濃度，將反應物和催化劑分配于下相，產物分配于上相，實現反應與產物分離與耦合，既消除了產物的水解和底物抑制問題，同時酶的活性在高聚物以及鹽溶液體系得到了保持，從而提高了催化反應的效率。Hernandez-Justiz等[38]在聚乙二醇（600）-硫酸銨雙水相體系中，利用青霉素G 酰化酶催化合成頭孢氨芐，較單相酶促反應的產率提高了35 %。Wei等[39]在聚乙二醇（400）-硫酸鎂組成的雙水相體系中合成頭孢氨芐，產率比傳統反應體系中提高了39%。作者用環氧基功能化介孔分子篩 SBA-15 固定青霉素酰化酶在雙水相體系中合成氨芐西林[40]，產率為80 %，而在水相體系中合成氨芐西林，其產率僅為27 %。

反膠束體系和雙水相體系很好地解決了酶在有機溶劑中的失活問題，同時能夠有效控制底物和產物的水解，在半合成β-內酰胺抗生素中得到了應用。但也存在表面活性劑以及雙水相體系黏度大，目標產物從反應體系分離困難，反膠束體系中表面活性劑對底物產生污染等問題，這些問題的解決仍需要進行大量的研究工作。

3 結 語

手性藥物的立體化學特性會影響其藥效或產生毒性，光學純手性藥物的開發已經在世界各地廣泛地開展，酶催化已在一些手性藥物和中間體中得到了應用，但對于已知的2000多種酶的總體而言，這些酶中只有極少數被用于有機合成中，這其中尚有需要研究解決的生物問題，也有化學問題，而適宜于某一有機合成反應溶劑的選擇是需要的，有時甚至是必需的。盡管目前對于溶劑效應的行為機理不是十分清楚，但溶劑對酶活性和選擇性產生的影響，在酶催化合成手性化合物中的調控作用日顯突出，有時確實是巨大的。隨著蛋白工程和工業微生物的不斷發展，穩定的、耐有機溶劑的、廉價的適用于多種底物的酶的不斷開發，隨著溶劑效應機理的揭示和溶劑工程的應用，伴隨著當今有機化學、生物化學和微生物學等多學科的交融發展，酶在手性藥物合成中的應用會更為廣闊，在工業生產方面會取得更多突破。

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Solvent effect on catalytic synthesis of chiral compouds with lipase and penicillin G acylase

XUE Ping，CAO Xuerong
（Key Laboratory of Energy Resources and Chemical Engineering，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Synthesis of chiral drugs and intermediates catalyzed by enzyme has high efficiency，energy saving and environment-friendliness advantages. This paper reviews the solvent effect on the enzymatic reaction in non-aqueous media with lipases，namely，the activity and enantioselectivity of enzyme adjusted by solvent system to improve the efficiency of catalytic reaction. The kinetically controlled synthesis of β-lactam antibiotics with penicillin G acylase was introduced in different solvent systems，including the organic-water miscible solvents，organic-water immiscible solvents，reverse micelles and aqueous two-phase system. The yield of kinetically controlled synthesis of β-lactam antibiotics and synthesis/hydrolysis ratio（S/H）could be enhanced by designing an effective solvent system to better utilize the substrates.

solvent effect；lipase；penicillin G acylase；chiral compands；enantioselectivity

O 643.4

A

1000–6613（2011）07–1577–07

2010-12-21；修改稿日期：2011-01-17。

國家973計劃前期研究專項（2010CB534916）及國家自然科學基金（21064005）項目。

及聯系人：薛屏（1962—），女，博士，教授，主要從事生物催化研究。E-mail ping@nxu.edu.cn。