基于RNA干擾技術和MICRORNA調控的丙型肝炎治療研究進展

劉艷寧，樓國華，陳 智 綜述

(傳染病診治國家重點實驗室、浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病研究所，浙江杭州310003)

1 丙型肝炎治療現狀

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是導致肝硬化和肝細胞癌的主要病原體之一，全球約有1.7億人感染了HCV，中國人群HCV感染率約3.2%，估計全國感染者在4000萬以上，其中50%～85%的感染者不能有效清除病毒而發展為慢性丙型肝炎(慢丙肝)［1］。慢丙肝及其終末期肝病(肝硬化、肝癌)是肝移植的常見適應證，但是移植后常會發生HCV的再次感染而導致肝病復發。令人遺憾的是，尚無針對HCV感染的有效疫苗或抗體。目前常規的治療丙肝的方案是Peg-IFN-α聯合利巴韋林，但其療效與病毒基因型及病毒滴度密切相關，仍有約一半的患者不能產生持續病毒學應答(SVR)而清除病毒。另外，干擾素和利巴韋林的昂貴費用及其嚴重的副作用也限制了它們的使用。

HCV細胞培養體系的建立加速了對HCV生物學基礎的認知。近年來一系列治療新靶點的發現，衍生出利用這些新型病毒酶抑制劑、免疫調節分子、抗體、反義RNA或治療性疫苗的丙肝治療新策略。在這些新手段中，RNA干擾(RNA interference，RNAi)是抗病毒治療中最具前景的方法之一。

RNAi由21個核苷酸的siRNA啟動，能直接以化學合成的siRNAs形式導入細胞，也可間接以雙鏈RNAs的形式由載體導入細胞，能在轉錄后水平序列特異性地抑制基因的表達。dsRNAs或shRNAs首先被Dicer酶切割成具有活性的siRNA，然后這些siRNA組裝成多組分的復合物，即RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，該復合物再與一條作為靶向引導序列的單鏈siRNA相結合，繼而沉默對應的 mRNA［2］。這種簡單、有效、特異的基因沉默體系大大加速了HCV治療新靶點的發現，同時也加速了治療新方法的發展。另外，近期研究發現宿主細胞內源microRNAs(miRNAs)具有調節HCV復制的功能，這有望作為一種極具前景的新型治療手段［3］。下面對 HCV治療中基于 RNAi和miRNA的抗病毒策略的發展現狀和前景作一綜述。

2 RNAi在丙肝治療中的應用

2.1 病毒靶點 HCV全基因組包括5＇和3＇端的非編碼區(non-coding region，NCR)，和一個開放閱讀框(ORF)，編碼4種結構蛋白(E1，E2，core，p7)和 6 種非結構(NS)蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。HCV 可分為6 個基因型(1 ［a，b，c］，2［a，b，c］，3［a，b ］，4a，5a，6a)及70多個亞型，各基因型核苷酸序列間具有31%～34%的差異，亞型間具有20%～25%的差異。由于HCV是單股正鏈RNA病毒，其基因復制需要先合成全長負鏈RNA中間體，然后負鏈RNA再作為模板而合成新的正鏈RNA。NS5B是 HCV RNA依賴的 RNA聚合酶，它是合成正、負鏈基因組所必需的。病毒5＇NCR的內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)與40S核糖體亞基相結合，進而啟動HCV病毒蛋白的合成［4］。

RNA病毒基因組既作為病毒mRNA，又要作為病毒復制的模板，因此，HCV基因組是RNAi的敏感靶點。又因為HCV復制多在細胞質中進行的，因此使其對 RNAi更為敏感。IRES是HCV基因組中最為保守的序列，所以它可以作為RNAi的理想靶點。有研究顯示，在細胞模型中導入針對IRES的siRNA能降低HCV感染顆粒的釋放［5］。另外，HCV結構和非結構蛋白中的保守區域也能作為RNAi的靶點。近年來，多項研究顯示針對HCV非結構序列(NS3，NS4B，NS5A 和 NS5B)［6］和 HCV IRES域的RNAi都能有效抑制HCV的復制［7］。

NS5B缺乏校對功能，因此HCV具有高突變率，并且慢丙肝患者中HCV復制率較高，這就形成了不計其數的準種，從而使得HCV能逃逸序列嚴格限定的RNAi作用［8］。已有研究發現，在siRNA作用壓力下，HCV的siRNA靶序列中產生了具有點突變的復制子［9］。

2.2 宿主細胞靶點 HCV細胞培養體系的發展，加速了對HCV生活史及其與宿主細胞聯系間的認識。研究發現多種宿主分子在HCV感染中具有重要意義，如 CD81、SR-BI、Claudin-1和occludin等［10-13］，這些宿主因素共同作用于病毒感染的各個環節。另外還發現，許多宿主分子與病毒復制相關，如F-box、FBL-2、VAP-A、VAP-B、FKBP8 和熱休克蛋白等［14-16］。基于單個靶點的RNAi以及基于多個靶點的全基因篩查技術大大加快了對HCV治療新靶點的發現，多數新發現的宿主分子參與了信號轉導，基因轉錄，蛋白合成和RNAi途徑，但其具體機制尚待進一步研究。

哺乳動物DNA聚合酶具有高保真的校對功能，而使宿主基因變異率要遠低于HCV，因此針對宿主基因的RNAi能較好的回避突變逃逸。例如，通過RNAi敲除CD81，能大大降低HCV E2蛋白結合到人肝癌細胞上［17］。最近有研究顯示，抗CD81的抗體能保護人肝-uPASCID小鼠免受多種 HCV毒株的感染［18］。利用RNAi下調Huh7細胞中SR-BI的表達，可明顯抑制 HCV假病毒顆粒的感染［19］。與 HCV非結構蛋白(如NS5A和NS5B)功能相關的宿主細胞基因，也可作為抑制病毒復制的RNAi靶點［20］。

雖然抗病毒治療中的RNAi可把上述宿主分子作為靶點，但該策略有一個明顯的弊端，即可能對肝細胞的內穩態產生嚴重的副作用。所有已確認的宿主分子都對肝細胞功能有重要作用，沉默這些基因可能對肝細胞功能和存活產生負面效應。因此，在把這些宿主分子作為臨床治療靶點之前尚有待進一步研究。

2.3 動物模型 雖然最早是在黑猩猩模型上發現了HCV，但大規模利用其作為實驗動物會受到倫理學和高成本的制約。在小鼠或大鼠中植入含亞基因組HCV復制子或是感染病毒顆粒的肝癌細胞可以作為替代模型，但是這種腫瘤模型與天然感染模型仍有較大差異［21-22］。近來，嵌合體小鼠模型的發展促進了HCV病毒學和抗病毒治療的研究。這種免疫缺陷小鼠模型攜帶了小鼠uPA基因(該基因能引起嚴重的肝臟毒性)，移植人肝細胞后，可在小鼠體內構建人源性肝臟，從而能被HCV感染［23］。然而，該免疫缺陷小鼠模型并不適用于研究抗HCV的或針對RNAi和基因治療載體的免疫應答。

通過在小鼠肝臟中共轉抗NS5B的shRNA表達質粒，以及熒光素酶(luciferase)-NS5B融合質粒，已經證實 RNAi具有抗 HCV的作用［24］。但 RNAi的臨床療效仍需在合適的動物模型中進行驗證。更加穩定和易于操控的小動物模型的發展，將對于在人源性的免疫環境中進行HCV感染機制和抗病毒治療的研究具有重要意義。

3 siRNA和shRNA的肝靶向傳遞

3.1 化學合成的siRNA RNAi在丙肝治療中的應用，需要有效的肝臟靶向運輸系統。研究早期，廣泛應用化學合成的siRNAs，但其存在許多缺陷，如細胞滲透性差，易于降解，以及脫靶后產生的負面作用等［25］。因此，肝臟靶向性的實現需要采用經過適當修飾的裸天然siRNA。

已經發現一些化學修飾能改善siRNA的特性，如寡核苷酸鏈、鎖核酸(LNA)、2＇-修飾的RNA、4＇-thio修飾的 RNA和核苷酸 mimics等［26］。化學修飾能顯著提高 siRNAs的穩定性，增強其肝靶向性，并提高其基因沉默效力，同時降低細胞毒性和免疫刺激副作用。另一種策略是把 siRNAs交聯到小分子或蛋白上，siRNA與抗體、維他命A-脂質體或陽離子脂質體相結合后，具有肝臟靶向性的RNAi運輸作用［27-28］。肝特異性的配體與修飾后的siRNAs相結合后能進一步提高其靶向性，從而降低副作用和非特異性。

3.2 載體表達的shRNA RNAi只有實現長效和穩定的沉默，才能作為慢丙肝的治療方案。基于基因治療載體表達的shRNA能產生相對長效和持久的沉默。多數基因治療載體是經過修飾的病毒，目前RNAi運輸中使用最多的病毒載體是腺病毒、腺相關病毒和慢病毒等。

腺病毒載體是最早發現的載體系統，能有效導入增殖的細胞。最近研究發現，尾靜脈注射表達HCV shRNA的腺病毒載體，能特異性地抑制HCV轉基因小鼠肝臟中HCV基因組RNA和蛋白的合成［29］。但在臨床應用中仍面臨一些擔憂，其中主要的障礙是針對腺病毒載體的免疫反應。RNAi運輸的另一個問題是，腺病毒高表達小的非編碼RNAs，會以競爭性底物的形式占據Dicer和RISC復合物進而干擾RNAi途徑［30］。最新的第三代腺病毒載體已克服了上述缺陷，載體中所有病毒編碼序列均被填充DNA和轉基因替代［31］。最新研究表明，第三代腺病毒載體攜帶的shRNA能抑制肝臟中靶基因的表達，但高水平的shRNA表達會激活干擾素應答［32］。腺相關病毒(AAV)載體也能用于shRNA的運輸。雖然AAV血清型2(AAV2)是最先發現的用于基因運輸的AAV，但針對AAV2的免疫反應制約了其臨床應用。AAV8是新發現的AAV家族成員，它不易被已有的人類抗體所識別，并能使shRNA的運輸效率提高近百倍［33］。通過構建自身互補的AAV載體進一步改進了單鏈AAV載體特性，它能在脫殼后退火形成穩定的具有轉錄活性的DNA二聚體［34］。

慢病毒載體來源于HIV-1，它與其它載體的不同在于它能整合入宿主基因，因此能介導shRNA的長效表達。然而，來源限制以及潛在的安全問題限制了其臨床應用。目前新開發的第三代VSV-G假病毒HIV-1和HIV-2載體，能克服上述問題。第一代shRNA由聚合酶III啟動子來表達，這常導致shRNA過表達而引起急性細胞毒性反應［35］。而第二代shRNA模擬了pri-miRNA的結構，因此能通過聚合酶II啟動子來表達［36］，從而提高了其安全性。

慢丙肝晚期常需進行肝移植，但如何防止丙肝復發仍是臨床面臨的巨大問題。病毒載體介導的RNAi，能通過對移植物進行操作而避免HCV復發。在肝移植前需多次灌注來清除肝臟血液。肝臟的體外灌注為肝靶向性的基因治療提供了絕佳機會。早期研究證實，對冷凍保存的大鼠肝臟移植物以復制缺陷腺病毒載體進行體外灌注，能提高轉基因的攝入和表達［37］。慢病毒載體具有穩定并長期表達shRNA的能力，因此，利用滅活的慢病毒載體，介導RNAi而保護肝臟移植物免受HCV的再次感染是最為合適的。

4 microRNAs在HCV感染中的作用

4.1 microRNAs對HCV復制的調控 越來越多的研究顯示miRNA參與了病毒感染，miR-122是最早被發現的與HCV復制相關的宿主miRNA［3］。miR-122 能與 HCV 5＇NCR 的兩個靶位點相結合，該結合是病毒復制所必需的。這兩個miR-122結合靶點由一序列保守的短片段相間隔。但該靶點與普通的miRNA靶序列完全不同，通常情況下 miRNA靶向結合3＇NCR而導致 mRNA的抑制或降解［38］。然而，把HCV miR-122結合位點插入報告基因mRNA的3＇NCR后，則會引起該mRNA表達下調，這表明miR-122結合位點的定位在基因調節中具有重要意義［39］。

此外，miR-122還能通過調控血紅素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)的表達而間接影響HCV復制，HO-1是一種能抑制HCV復制的關鍵酶［40］。最近研究發現，miR-122通過在翻譯起始階段增強核糖體與病毒RNA的結合而刺激 HCV 復制［41］。研究還發現，IFN-β 能調節多種包括miR-122在內的細胞miRNAs的表達，其中有8種 miRNAs根據序列預測在HCV基因組中具有靶點。這些發現表明，哺乳動物能利用細胞miRNAs的干擾機制來對抗病毒感染［42］。近期有一項臨床研究顯示，miR-122的表達在IFN-α難治型的HCV患者中明顯下調，進一步證實了IFN應答與miRNA間的聯系［43］。而 Yoshiki等人的最新研究顯示，miR-122a在獲得持續病毒學應答(SVR)的丙肝患者的肝組織中的表達水平要高于無病毒學應答(NR)的患者，提示miR-122a可能也與患者的IFN應答相關［44］。另外，最近研究還發現miR-199a能抑制 HCV 復制［45］。

4.2 miRNAs的臨床靶點 miRNAs是HCV生活史中一類新的細胞分子。miR-122對HCV復制起正向調節作用的這一發現，以及現有的操控miRNA功能的技術手段，為針對HCV感染的miRNA靶向治療策略的發展提供了基礎。我們可通過傳統的反義技術來抑制miR-122功能，該手段能在多個水平影響miR-122，如通過結合成熟的pre或pri-miR-122而阻斷其功能。然而，傳統反義核苷酸 (antisense oligonucleotides，ASO)效率低下，常需要通過另外的修飾來提高其生物效能。2＇-O-甲基化(OMe)的ASO對兩種HCV亞基因型細胞模型中HCV RNA抑制率可達84%［40］。此外，MOE(2＇-O-methoxyethyl phosphorothioate)修飾也能有效抑制肝臟中miR-122活性［46］。

鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)修飾是最新的一種手段。LNA其部分核糖上的2＇與4＇碳基經亞甲基橋連結在一起，使得其與互補核酸鏈的配對更為迅速并提高了其結合的穩定性［47］。研究發現靈長類動物輸注LNA-antimiR后，其肝細胞可攝入 LNA-antimiR，并在 LNA-antimiR和miR-122間形成穩定的雜交雙鏈，從而抑制肝臟miR-122功能，但并未發現LNA相關的細胞毒性或是組織病理學改變［48］。

miR-122沉默還能通過肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)或 2＇Fluoro/2＇OMe 嵌合修飾的ASO來實現。把反義PNA交聯到一種細胞穿膜肽上以后，無需轉染即能抑制人和大鼠細胞系中的miR-122，這突顯了其臨床應用的優勢［49］。而 2＇Fluoro/2＇OMe 嵌合的 antimiR-122 ASO具有更高的效率，與LNA ASO相比其效率提高了5～10倍［50］。相反，已知 miR-199a能抑制病毒的復制，因此，過表達 miR-199a也可作為一種臨床策略［44］。

5 RNAi臨床應用的限制因素

5.1 耐藥和突變逃逸 與已有的單一抗病毒治療手段一樣，單純RNAi治療也難以完全控制感染，從而可能形成耐藥準種。因此，成功控制HCV感染需采用聯合治療策略。RNAi的嚴格序列特異性存在一個缺點，即HCV靶序列單個核苷酸的突變就能破壞其識別和沉默作用，但可通過同時靶向多個病毒序列而避免該問題。內切酶加工后的siRNAs能同時靶向HCV基因組的多個位點，從而避免逃逸并有效抑制HCV 復制子的復制［51］。另外，多靶點的siRNAs也能通過Dicer酶切割天然的或載體攜帶的雙鏈長RNA而得到［52-53］。

第二種策略是同時針對病毒和宿主基因序列。已經發現，細胞蛋白酶α亞基7(PSMA7)和HuR能與HCV相結合［54-55］。聯合應用靶向PSMA7-和 HuR-的 siRNAs與靶向 HCV 的siRNAs，可對HCV復制子產生進一步的抗病毒效果［56］。同樣，聯合采用靶向HCV RNA和靶向CD81的shRNAs，能同時干預病毒侵入和復制兩個環節［57］。三倍體 shRNA盒由三個 H1啟動子啟動，它與單一的shRNA相比能更加有效地抑制HCV復制，以及由CD81介導的E2結合。

IFN-α具有間接的抗病毒能力，它通過激活非病毒特異性的抗病毒基因而發揮作用。因此，聯合應用RNAi和IFN-α可避免治療性耐藥，并具有更好的抗病毒效果。研究發現慢病毒介導的RNAi和IFN-α能獨立抑制HCV復制，兩者的抗病毒效果不會產生相互影響［58］。泛素特異蛋白酶18(ubiquitin specific protease 18，USP18)的上調與患者的IFN治療不應答相關，研究發現沉默USP18能提高IFN的抗HCV效果，提示聯合運用RNAi和IFN-α具有可行性［59］。另外，聯合運用 RNAi與利巴韋林、核酶、ASO或小分子抑制劑的可行性也有待進一步研究。

5.2 病毒對RNAi的干擾 與其它多種病毒一樣，HCV也能通過多種機制來破壞RNAi的抗病毒作用。已經發現表達HCV多蛋白后，siRNA介導的基因沉默可被抑制。HCV結構蛋白E2通過與RISC復合物中的Argonaute-2(Ago-2)相結合而抑制 RNAi［60］。還有人發現HCV核心蛋白也能抑制shRNA介導的基因沉默，進一步研究顯示，其核心蛋白N端的62個氨基酸與RNAi抑制相關［61］。

6 展望

大量研究表明，RNAi在了解HCV生物學特性及作為臨床治療策略方面具有重要意義。通過RNAi篩查方法已確認諸多宿主分子參與了病毒生活史的多個階段，為了解病毒-宿主相互作用提供了重要依據，并揭示出很多潛在的治療靶點。miR-122作為HCV復制的正調節因子的發現，使人們對開發基于ASO的臨床治療策略產生了濃厚興趣。然而，miRNA靶點的選擇和其他宿主因素尚需慎重考慮，因為至今對其生理學功能尚未完全了解。

雖然HCV RNA基因組是RNAi的靶點，但基于單一RNAi的靶向治療策略常由于其高突變率，遺傳多樣性，復雜的基因結構，以及病毒對RNAi的抑制等方面原因，而達不到預期效果。因此，選擇多個病毒靶點，或聯合病毒靶點和宿主分子靶點，甚至與傳統治療方式相結合，將有助于提高療效。隨著基因運載技術的進步，運用RNAi治療丙肝顯示出美好前景。當然，在正式應用于臨床前，還需借助HCV的小動物模型來進一步評價RNAi在體內的長期療效，免疫能力等，以填補體外實驗研究與患者臨床治療間的空隙。

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