要重視微小RNA在HCV感染和防治研究中的作用

陳 智

(浙江大學醫學院附屬第一醫院傳染病研究所、傳染病診治國家重點實驗室，浙江杭州310003)

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是引起慢性肝病的主要原因之一，全球約有HCV感染者1.7億人。HCV感染后，約50% ～85%的感染者不能有效清除病毒而發展為慢性丙型肝炎，其中20% ～30%發展為肝硬化，1% ～5%轉為肝細胞肝癌(HCC)，嚴重危害人類健康［1］。目前，國內外尚無能夠有效預防HCV感染的疫苗問世。臨床上對丙型肝炎推薦采用聚乙二醇長效α-干擾素(Peg-IFN-α)聯合利巴韋林(Ribavirin)進行治療，其療效與病毒基因型和宿主基因多態性(如IL-28B位點)密切相關［2］。HCV基因1型患者經該方案治療1年后，仍有約一半的患者不能產生持續病毒學應答(sustained virological response，SVR)［3］。最近雖然用小分子物質如Telaprevir+標準RGT方案進行治療，療效有所提高，但仍有不少問題需要進一步解決。因此，研究其相關的機制，選擇合理的藥物靶點，對研發新的高效抗病毒藥物具有十分重要的意義。

近年來，HCV假病毒顆粒(HCV pseudotype particles，HCVpp)［4］及 HCV 細 胞 培 養 體 系(HCV grown in cell culture，HCVcc)［5］的建立，大大推動了對HCV生命周期和生物學基礎的認識。一系列治療新靶點的發現，衍生出利用這些新型病毒酶抑制劑、免疫調節分子、抗體、反義RNA和治療性疫苗的丙型肝炎治療新策略，以及微小 RNA(microRNAs，miRNAs)調節HCV復制的功能［6-9］，均成為研究者關注的熱點。

1 miRNA與丙型肝炎發病機制

越來越多的研究顯示，miRNA與病毒感染的過程密切相關。首先，丙型肝炎患者肝臟中有多種 miRNAs表達異常。Peng等運用miRNA芯片技術對丙型肝炎患者肝組織和正常肝組織的miRNA表達水平進行了比較分析，發現，前者 miR-122、miR-320、miR-193、miR-181、miR-296等miRNA表達下調，而miR-215、miR-16、miR-26、miR-130、miR-199、miR-155 等的表達上調，認為這些miRNA可能與HCV感染及丙型肝炎的發展具有密切關系［10］。Grek等人和Bihrer等人的臨床研究分別顯示，丙型肝炎患者的外周血單個核細胞(PBMC)和血清中也存在多種miRNAs的異常表達［11-12］。魯兗等人基于Huh-7.5.1細胞HCV感染模型的研究發現，有13種 miRNAs(miR-10a、miR-149、miR-181a、miR-193a-3p、miR-200b、miR-210、miR-301b、miR-340、miR-365、miR-425、miR-616和miR-629及miR-99b)在HCV感染后表達上調，而有7種 miRNAs(miR-100、miR-140-5p、miR-148a、miR-152、miR-21 和 miR-27a及 miR-339-5p)則在HCV感染后表達下調，提示這些差異表達的miRNAs可能也與HCV的復制相關［13］。

這些微小RNA的表達變化與丙型肝炎病毒的復制水平以及丙型肝炎發病機制有較為密切的關系。例如，miR-122是肝臟特異性的miRNA，由肝控制區基因非編碼區(hcr)轉錄加工而成，在肝臟發育過程中起著重要的調節作用，約占整個肝臟表達的 miRNA總量的70%［14］。通過與 HCV 5＇-NCR 的兩個靶位點相結合，miR-122可上調HCV復制水平，是最早發現的與HCV復制相關的宿主miRNA［15］。而朱蕾等人的研究發現，miR-122可調節乙型肝炎病毒抗原表達，并可能潛在地影響HBV發病機制［16］。Banaudha等人發現 miR-141也能促進HCV復制，同時miR-141能沉默腫瘤抑制分子DLC-1，因此，miR-141可能與HCV感染導致HCC發生有關［17］。Ishida等人的研究顯示，miR-192/miR-215和miR-491與HCV的復制相關，miR-491通過PI3K/Akt途徑影響HCV的復制［18］。另外，有研究發現，miR-196和 miR-199a能抑制HCV-1b或-2a復制子細胞模型中HCV 的復制［19-20］。

2 miRNA與丙型肝炎靶向治療

鑒于miR-122和miR-141等對HCV復制有正調控作用，有望在臨床上開發出針對HCV感染的miRNA靶向治療策略。我們可通過傳統的反義技術來抑制miR-122功能，但傳統反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)效率低下，因此常需借助體外修飾，如2＇-O-甲基化 (2＇-OMe)、 MOE (2＇-O-methoxyethyl phosphorothioate)、肽核酸 (peptidenucleic acids，PNA)或 2＇-Fluoro/2＇-OMe 嵌合修飾來提高其效率［21-24］。鎖核酸(Locked nucleic acid，LNA)修飾是最新的一種手段。研究發現，對HCV感染的黑猩猩輸注LNA-antimiR或SPC3649(miR-122的互補LNA-修飾核苷酸)后，其肝細胞可攝入LNA-antimiR或SPC3649而抑制miR-122功能，進而抑制HCV復制，同時并未發現明顯的副作用［25-26］。相反，已知miR-199a和miR-196能抑制HCV的復制，因此過表達miR-199a或miR-196也可作為一種臨床策略。

3 miRNA作為丙型肝炎臨床診治和預警監測指標的意義

Marquez等人對丙型肝炎患者肝組織和正常肝組織的miR-122、miR-21表達水平，與臨床指標進行了關聯分析，發現miR-21表達水平與病毒滴度、纖維化程度和血清ALT、AST水平呈正相關，而miR-122表達水平與纖維化程度和血 清 ALT、 AST 水 平 呈 負 相 關［27］。Bandyopadhyay等人發現，丙型肝炎患者肝組織中miR-29的表達下調，而miR-29可抑制肝星狀細胞(HSC)的增殖和分泌膠原，因此，miR-29可能與慢性丙型肝炎患者的纖維化進程相關［28］。另有報道，慢性丙型肝炎患者的PBMC中miRNA-155和miRNA-196b表達水平與HCV RNA載量相關［9］。血清中 miR-122表達水平與丙型肝炎患者血清ALT指標和炎癥活動度呈正相關［10］。

上述研究結果顯示，丙型肝炎患者較之健康人，其肝臟、PBMC和血清中存在多種microRNAs的表達差異，尤其是其血清或PBMC中的差異miRNAs，有望作為丙型肝炎病情進展和肝硬化的新型預警及監測指標。

4 miRNA作為丙型肝炎抗病毒治療預后評價指標的意義

最近的幾項臨床研究顯示，miRNAs與丙型肝炎患者的干擾素(IFN)治療應答也存在一定關聯。Sarasin-Filipowicz等人的研究表明，miR-122的表達在IFN-α難治型HCV患者的肝臟中明顯下調［29］。Murakami等人發現，IFN治療后獲得SVR的患者與無應答(non-responder，NR)的患者相比，肝臟中 9種miRNAs的表達水平有明顯不同，其中，4種miRNAs(miR-27b、miR-378、miR-422b和 miR-122)的表達水平SVR組要明顯高于NR組，而另外 5 種 miRNAs(miR-34b、miR-145、miR-143、miR-652和miR-18a)的表達水平SVR組要顯著低于NR組［30］。Scagnolari等人的研究發現，健康志愿者和慢性丙型肝炎患者的PBMC在體外經 IFN刺激后，miR-1、miR-30、miR-128、miR-196和 miR-296的表達均上調，但其上調程度兩組間有差異，而且這5種miRNAs的上調比例在 SVR組中要高于 NR組［31］。根據序列預測分析，這5種 miRNAs在HCV基因組中均有靶點［32］。魯兗等人進一步對HCV感染細胞模型加干擾素干預后的mi-RNA表達譜進行了分析，發現13種miRNAs在HCV感染后表達上調，但在干擾素干預后出現下調;而另外7種miRNAs在HCV感染后表達下調，而在干擾素干預后發生上調，提示這些差異表達的miRNAs可能也與丙型肝炎患者IFN應答相關［11］。另外，李蘇娟等研究了miR-122對IFN-α抗HCV效應的影響，發現在HCV細胞感染模型中，miR-122模擬物呈劑量依賴性促進HCV RNA復制，而IFN-α的抗病毒效應與HCV載量呈反比，顯示miR-122可能通過影響HCV載量而影響IFN-α的抗HCV效應［33］。

上述研究結果顯示，miRNAs在IFN應答和無應答患者間存在差異，聯合分析某些特異的miRNAs，有望作為丙型肝炎患者抗病毒治療效果的一種新型的預后評價指標。

5 miRNA研究中存在問題與研究方向

綜上所述，miRNAs的表達失調與丙型肝炎的病毒感染及疾病進展密切相關，因此，研究基于miRNA調控的HCV臨床治療新策略具有十分重要的意義。然而，由于一種miRNA能調控多種靶基因，miRNA的生物學功能常不能僅從其單一靶基因作出推斷。雖然miRNAs靶基因可通過計算機模擬分析來確定，但該技術也僅能預測約50%的調控靶點。另外，miRNAs能通過聯合調控一系列靶點，而影響某種特定表型，即表型常由多個靶點來共同調控。miRNAs對單個mRNAs靶點的調控效應是部分的，而多個靶點的共同調節會產生協同的表型改變。因此，當miRNA應用于臨床時，其靶點的選擇和其他宿主因素尚需慎重考慮。

目前，miR-122的抑制物已進入I期臨床研究階段，有望成為第一種基于miRNA的臨床治療策略，但其安全性和有效性正在作進一步臨床觀察。同時，對于這種特殊小分子的合理選擇和有效修飾及高效運輸等方面，還有待進一步深入研究。隨著對miRNAs研究的深入，一些以miRNA為靶點的試劑和新藥將不斷涌現，從而開辟對丙型肝炎臨床診斷和治療的新領域。

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