基于g23基因的武漢東湖T4類浮游病毒遺傳多樣性

黃慧珍,程 凱,許 敏,趙以軍(華中師范大學城市水環境生態學湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430079)

基于g23基因的武漢東湖T4類浮游病毒遺傳多樣性

黃慧珍,程 凱,許 敏,趙以軍*(華中師范大學城市水環境生態學湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430079)

選取武漢東湖的2個子湖——郭鄭湖和廟湖,分別在冬季和夏季采樣,對T4類浮游病毒的g23基因進行PCR擴增,經連接轉化后,隨機挑選克隆子進行測序.結果表明,共得到46條有效序列,根據系統發育分析發現其明顯分為6個組,顯示出較高的多樣性且具有明顯的時空差異,說明富營養化水平的差異和季節變化將對浮游病毒的種群結構產生影響.僅部分g23序列與海洋T4類浮游病毒同源性較高,另一部分序列則可能代表了淡水富營養化水體中特有的浮游病毒類群.人為干擾會明顯影響某些淡水水體中T4類浮游病毒的遺傳多樣性.

g23基因；東湖；T4；浮游病毒；遺傳多樣性

浮游病毒泛指懸浮于水體中的各種病毒,包括噬菌體、噬藻體和真核藻類病毒等[1].浮游病毒個體雖然微小,卻是水體微生物群落中豐度最高的有機成分,其在水體生態系統中占據重要地位[2].國際上對浮游病毒多樣性的研究是在20世紀80年代以后興起,并且大部分研究都是針對海洋水體[3-4],以及稻田土壤和灌溉水[5].我國相關的研究剛剛起步,對淡水湖泊中的浮游病毒的多樣性研究還集中在電鏡觀察和脈沖場電泳等方法

[6-8].劉艷鳴等[8]對東湖浮游病毒研究發現,其病毒基因組大小以 20～60kb的核酸帶為強,這符合噬菌體和噬藻體的基因組主要范圍.證實了東湖浮游病毒的優勢類群為噬菌體和噬藻體.

g23基因編碼 T4類噬菌體的主要衣殼蛋白(MCP)gp23(該蛋白由 521個氨基酸構成),在應用全球海洋采樣(GOS)研究海洋浮游病毒宏基因組學的過程中,被發現是最具有代表性的蛋白質家族[3].Jia等[9]也建立了灌溉期間日本稻田表層土樣的g23克隆子文庫,由于土壤與海洋環境條件的明顯不同,其T4類浮游病毒的種類也大不相同.

鑒于目前國內外對淡水湖泊浮游病毒研究尚少,國內對浮游病毒的遺傳多樣性研究仍為空白,本實驗以T4類浮游病毒的g23基因為對象來研究淡水富營養化水體中T4類浮游病毒的遺傳多樣性,不但有助于填補這方面的研究空白,而且將有助于推測淡水浮游病毒的生態功能及其對淡水水體富營養化的響應機制.

1 材料與方法

1.1 水樣采集與處理

選取武漢東湖的 2個子湖——郭鄭湖和廟湖,分別代表輕度富營養化和重度富營養化湖泊.在2009年3月8日和8月5日上午,用有機玻璃采水器采取郭鄭湖和廟湖表層水樣,裝入棕色玻璃瓶,用 1%氯仿或戊二醛固定,4℃保存,一周內進行濃縮處理.

冬季采集的水樣須先濾過孔徑為0.22μm的混合纖維膜,再用 TFF膜包(PALL公司,100kD),進行反沖超濾濃縮[17],1L水樣最終濃縮為 20～30mL,分裝入1.5mL塑料離心管,-20℃保存待用.夏季采集的水樣在濾過0.22μm的混合纖維膜前,先用普通定性濾紙過濾,其余步驟同冬季水樣.

1.2 方法

1.2.1 浮游病毒總 DNA提取 取 600μL病毒濃縮液,加入粗制的DNase和RNase,使終濃度均為 1μg/mL,室溫放置 30～60min,8000r/min 離心5min,上清轉入新的塑料離心管,加入蛋白酶k和SDS,使終濃度分別為50μg/mL和0.5%,56℃裂解1～3h,8000r/min離心 5min,上清轉入新的塑料離心管,加入等體積飽和平衡酚,顛倒混勻,8000r/min離心 5min,上清轉入新的塑料離心管;加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),顛倒混勻,8000r/min離心 5min,上清轉入新的塑料離心管;加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),顛倒混勻,8000r/min離心 5min,上清轉入新的塑料離心管;加入 50μL3M 醋酸鈉和 1000μL 冰無水乙醇,-20℃沉淀過夜;13200r/min離心 15min,用預冷的 70%乙醇洗滌兩次,室溫干燥.用 20～30μL TE溶解30min,1%瓊脂糖電泳檢查.提取的DNA放于-20℃保存待用.

1.2.2 PCR擴增 50μL擴增體系中加入 10×Buffer 5μL,15mmol Mg2+3μL,10mmol dNTP 1μL,5U Taq 酶 0.25μL,上下游引物 10mmol各1μL,模板 DNA6μL.使用的程序是 94℃預變性5min,30個循環的 94℃變性 45s,50℃退火 60s,72℃延伸45s,72℃終延伸10min.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物.所用的引物為 MZIA1bis:5′-G ATATTTGIGGIGTTCAGCCIATGA-3′,MZIA6:5′-CGCGGTTGATTTCCAGCATGATTTC-3′[4](inv itrogen公司合成),能擴增出T4類浮游病毒的g23基因中450bp的片段.

1.2.3 克隆測序 使用 PMD18-T載體試劑盒(takara公司),隨機挑選10～20個陽性克隆,交由金斯瑞科技南京有限公司測序.

1.2.4 分析 使用 DNAstar5.0軟件包進行序列分析,用 mega4.0進行組內和組間發散度分析、CLUSTALW排序以及進化樹的建立(NJ法).

2 結果與分析

郭鄭湖和廟湖冬夏兩個季節共 4個水樣,經隨機克隆共得到 46條序列,具體如下(Genebank序列號為HM005246-HM005291):

表1 序列來源Table 1 Sources of sequences

表2 組間發散度Table 2 Estimates of evolutionary divergence over sequence pairs between groups

根據組內平均發散度計算結果得到:冬季郭鄭湖為0.365,廟湖為 0.411;夏季郭鄭湖為 0.517,廟湖為 0.342.郭鄭湖夏季水體的病毒之間的距離最大,即多樣性最大,廟湖夏季水體的病毒之間距離最小,多樣性最小.

每個水樣所得病毒序列作為一個整體,兩兩相比較發散度的計算見表 2,其結果顯示廟湖冬季與夏季病毒之間的差異最小,而郭鄭湖兩季之間的差異最大.

圖1 本研究所得序列與T4和典型海洋噬菌體[4]的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the sequences we obtained, T4 and the typical marine bacteriophages[4]

3 討論

3.1 基于g23基因序列的東湖T4類浮游病毒進化關系分析

根據本研究所得的 g23序列與部分已報道的海洋噬菌體T4類浮游病毒的g23序列所構建系統發育樹(圖1),可將本研究所得序列分為6組(GP1～6)(具體分組情況如圖 2所示).由圖 2可見:GP1、GP2、GP5和 GP6的進化方向明顯不同于海洋T4類浮游病毒,而GP 3(包括3條序列)和GP 4(包括24條序列)則明顯與海洋起源的噬菌體的親緣關系較近,很可能與海洋噬菌體有共同的起源,說明淡水噬菌體與海洋噬菌體可能來源于共同的祖先[10].GP 4和GP 6分別包括有24和10條序列,共占所有序列的73.9%,均涵蓋本次研究中全部4個來源的樣品,是東湖中T4類浮游病毒的主要類群,其中,由于GP6與海洋噬菌體的親緣關系更遠,具有更加獨立的進化途徑,很可能代表淡水富營養化水體中T4類浮游病毒的典型類群;GP 1包括 3條序列(5-8,10-2,10-14),均來源于兩個湖泊的冬季水樣,很可能是冬季典型序列,并且該枝與其他所有序列的親緣關系都非常遠;GP 2分為2個進化方向,包括4條序列(s5-9,s5-11,s10-9,s10-10),均來源于兩個湖泊的夏季水樣,很可能都是夏季典型序列;GP 5僅包括兩個序列(s10-7,s10-8),均來自廟湖夏季樣品.

有報道表明海洋噬菌體群落的多樣性非常高[11-12],Ursula Dorigo等[10]對淡水噬菌體g20基因的研究結果也顯示出淡水噬菌體的多樣性十分豐富,本實驗從來自2個湖區的46條序列中即得到了6個明顯的類群,顯示東湖中T4類噬菌體也具有很高的遺傳多樣性.這可能是由于病毒和宿主間或感染相同宿主的病毒間的基因交換所導致[12-13].另一個假說認為,噬藻體群落的多樣性可能與宿主群落多樣性有關[14-16].

3.2 T4類浮游病毒遺傳多樣性的時間變化

3.2.1 郭鄭湖 T4類浮游病毒遺傳多樣性的時間變化 郭鄭湖為輕度富營養化,且受人為干擾較小(相對于廟湖而言).在系統發育樹上(圖1),該湖冬季序列與夏季界限明顯,幾乎完全位于不同的分支上,并且冬季序列的分布更加集中,多樣性較小,而夏季序列則占據較多分支,多樣性更豐富,這與組內發散度計算結果也一致.可能由于夏季浮游病毒數量遠高于冬季,且冬夏兩季宿主類型的不同,導致浮游病毒的種類區別較大[18-19].

圖2 本研究所得序列系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the sequences we obtained

3.2.2 廟湖 T4類浮游病毒遺傳多樣性的時間變化 廟湖為重度富營養化,2009年 6～10月期間,該湖形成了嚴重的銅綠微囊藻水華.與郭鄭湖不同的是,廟湖冬夏兩季的 g23序列之間并沒有明顯的界限,它們在進化樹上分布相對均勻(圖1),冬夏兩季的病毒種類之間并無明顯差異.由于廟湖毗鄰居民區和餐飲點,常年受到嚴重的人為干擾,人為因素將對浮游病毒的多樣性產生明顯影響,并在有可能一定程度上掩蓋自然(季節)變化對浮游病毒的影響[20],因此該湖兩個季節浮游病毒優勢種之間的親緣關系很近.另外,根據組內發散度結果,廟湖夏季病毒多樣性比冬季小,很可能是因為該水體夏季發生了嚴重的銅綠微囊藻水華,導致宿主生物的多樣性下降,從而使浮游病毒的多樣性隨之下降.

4 結論

4.1 隨機克隆的方法用來檢驗淡水水體浮游病毒多樣性是可行的.

4.2 淡水富營養化水體中的 T4類浮游病毒的遺傳多樣性較高且具有明顯的時空差異,說明富營養化水平的差異和季節變化將影響浮游病毒的種群結構.

4.3 淡水富營養化水體中,僅部分g23序列與海洋 T4類浮游病毒同源性較高,另一部分序列則可能代表了淡水富營養化水體中特有的T4類浮游病毒.

4.4 人為干擾會明顯影響 T4類浮游病毒的遺傳多樣性.

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Genetic diversity of T4 virioplankton, inferred from g23 gene, in Wuhan Donghu Lake.

HUANG Hui-zhen, CHENG Kai, XU Min, ZHAO Yi-jun*(Hubei Key Laboratory of Urban Water Environmental Ecology, Central China Normal University, Wuhan 430079, China). China Environmental Science, 2011,31(3)：443～447

2 sub-lakes in Donghu Lake: Guozheng Lake and Miaohu Lake were chosen, and sampled seperately in winter and summer. g23 gene of T4 virioplankton was amplified, randomly sequenced certain clones. 46 sequences were got.Phylogenetic analysis showed that these sequences fell into 6 independent groups and exihibited high diversity. The phylogenetic analysis also suggests that: 1) the eutrophication level and season change have something to do with the structure of virioplankton community; 2) only part of the sequences are closely related to marine T4 virioplankton, so the others may represent eutrophicated freshwater virioplankton; 3) anthropogenic forcing can obviously influence the genetic diversity of T4 virioplankton in certain freshwaters.

g23 gene；Donghu Lake；T4；virioplankton；genetic diversity

X172

A

1000-6923(2011)03-0443-05

2010-08-08

國家自然科學基金資助項目(30670088);國家科技重大專項資助項目(2009ZX07105-001);華中師范大學基本科研業務費資助項目

* 責任作者, 教授, zhaoyj@mail.ccnu.edu.cn

黃慧珍(1984-),女,湖北武漢人,碩士研究生,研究方向為水體浮游病毒遺傳多樣性鑒定.發表論文1篇.