糖基化反應條件對乳清蛋白
——麥芽糖復合物抗原性的影響

李錚，馮力更，鄭喆，廖萍，羅永康

(中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京100083)

糖基化反應條件對乳清蛋白
——麥芽糖復合物抗原性的影響

李錚，馮力更，鄭喆，廖萍，羅永康

(中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京100083)

研究了將麥芽糖通過糖基化引入到乳清蛋白制備乳清蛋白-麥芽糖，用間接競爭ELISA法測定不同反應時間不同質量比的乳清蛋白-麥芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性的變化。結果表明，糖基化能有效降低α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性，α-乳白蛋白的抗原性可以從26.2 mg/L降低到14.4 mg/L，β-乳球蛋白的抗原性可以從95.1 mg/L降低到22.4 mg/L。反應時間對不同質量比的乳清蛋白-麥芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性有較大影響。蛋白與糖的質量比為1～8時，反應相同時間的乳清蛋白-麥芽糖中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原性隨蛋白與糖的質量比的下降而下降。

乳清蛋白；麥芽糖；糖基化；抗原性

0 引言

乳清蛋白中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是引起牛乳過敏的主要過敏原[1]，通過改性降低乳清蛋白過敏原的主要方法有熱處理、高壓[2]、酶解[3]、糖基化、發酵[4]等。目前有一些關于糖基化反應降低乳清蛋白抗原性的報道,Enomoto等[6]將麥芽五糖結合到α-LA上，降低了α-LA的抗原性。Corzo-Martinez[7]將半乳糖和塔格糖引入到β-LG，有效的降低了β-LG的抗原性。另外有研究表明通過糖基化反應將低聚果糖和三甲基殼聚糖分別結合到大豆蛋白和卵清蛋白上，能有效的降低其抗原性[10，11]。

目前還沒有關于將麥芽糖通過糖基化反應引入到乳清蛋白對α-LA和β-LG抗原性影響的研究，本研究旨在通過糖基化反應將麥芽糖引入到乳清蛋白制備乳清蛋白-麥芽糖，探索反應時間和蛋白與糖的質量比對乳清蛋白-麥芽糖中α-LA和β-LG抗原性的影響。

1 實驗

1.1 材料

乳清分離蛋白（WPI）；麥芽糖；α-乳白蛋白（α-LA），L5385；β-乳球蛋白(β-LG)，L3908；兔抗α-LA血清（自制）；兔抗β-LG血清（自制）；HRP標記的羊抗兔IgG，A6154。

1.2 方法

1.2.1 WPI-麥芽糖的制備

將WPI和麥芽糖按照質量比8∶1，4∶1，2∶1和1∶1溶解于去離子水中，溶液最終質量濃度為100 g/L。將溶液于-60℃中預凍6 h后，在-60℃冷凍干燥24 h左右。將冷凍干燥制得的凍干粉放入底部盛有飽和KBr（相對濕度79%）的干燥器中，60℃反應0～120 h，所得WPI-麥芽糖共價復合物溶解于去離子水中，溶液最終質量濃度為100 g/L，再次冷凍干燥，得到的凍干粉于-20℃冰箱中貯存。同時，將WPI在相同的干熱條件下處理作為對照樣品。

1.2.2 色澤測定

420 nm波長是美拉德反應產生的棕色產物的特征波長。將糖基化復合物溶解于去離子水中，使溶液中蛋白質量濃度為1 g/L,測定其在420 nm處的吸光度值。

1.2.3 游離氨基酸殘留量測定

采用三硝基苯磺酸法（TNBS法）。取0.25 mL的樣品（1 L中含有的氨基量在0.25×10-3～2.5×10-3之間）與2 mL磷酸緩沖溶液（pH=8.2）和2 mL質量分數為0.1%的TNBS溶液混合，在50℃的暗室中放置60 min。反應完畢后，用4 mL濃度為0.1 moL/L的HCl終止反應，在室溫下放置30 min，于420 nm下測其吸光值。用濃度為0～5.0×10-3moL/L亮氨酸作標準曲線，通過標準曲線轉換成亮氨酸的濃度。游離氨基酸殘留量即為糖基化反應后的WPI-麥芽糖中游離氨基酸的濃度與未反應的WPI中游離氨基酸的濃度的比值。

1.2.4 乳清蛋白-麥芽糖抗原性的測定

采用間接競爭ELISA法。

(1)抗原包被。用包被液（濃度為50 mmol/L，pH值為9.6的碳酸鹽溶液）將一定質量濃度的抗原（α-LA質量濃度0.5 mg/L；β-LG質量濃度1 mg/L）包被于96孔酶標板，每孔100 μL，4℃過夜。

(2)樣品和抗血清預混合。在反應管中加入蛋白質量濃度為0.1 g/L的樣品（或標準品）和相同體積一定稀釋度（α-LA，1︰256 000；β-LG，1︰128 000）的抗血清。不加樣品（或標準品）只加抗血清的反應管作為無競爭體系，4℃冰箱過夜。

(3)洗滌。次日傾去孔內液體，PBST（PBS+0.05%Tween-20）洗滌4次，每次3 min，于吸水紙上拍干。

(4)封閉。加封閉液（PBS+1%BSA+0.1%Tween-20）進行封閉，每孔100 μL，37℃1 h，PBST洗滌4次，拍干。

(5)抗原抗體反應。加入（2）中樣品和抗血清的預混液，每孔100 μL，37℃1 h，PBST洗滌4次，拍干。

(6)加酶標二抗。加入稀釋10 000倍的羊抗兔IgGHRP標記物，每孔100 μL，37℃反應1 h，PBST洗滌4次，拍干。

(7)顯色。加入新鮮配制的TMB底物溶液，每孔100 μL，37℃反應10 min，顯示藍色。

(8)終止反應。每孔加入濃度為2 mol/L的H2SO450 μL終止反應，顏色變為黃色。

(9)吸光值測定。利用酶標儀雙波長測定各孔的OD450和OD630值，實際OD=OD450-OD630。

1.2.5 標準曲線的建立

將標準品稀釋成系列濃度，進行間接競爭ELISA測定。將各濃度對應的OD值轉換成B/B0%值，無抗原抑制時的OD值為B0,各相應濃度抗原抑制時的OD值為B，以B/B0%為縱坐標，以相對應濃度的對數lg[α-LA]（或lg[β-LG]）為橫坐標，制作標準曲線。選擇標準曲線上B/B0%與lg[α-LA]（或lg[β-LG]）呈明顯相關的區段根據公式Logit(B/B0%)=ln[B/(B0-B)]計算各標準點的Logit(B/B0%),再做對應于lg[α-LA](或lg[β-LG])的Logit(B/B0%)回歸分析,得出線性回歸方程及相關系數。根據標準曲線計算各樣品的抗原性。

2 結果與討論

2.1 反應時間對WPI-麥芽糖的色澤的影響

圖1為反應時間對不同質量比的WPI-麥芽糖色澤的影響。由圖1可以看出，干熱處理的WPI在420 nm處的吸光值僅有很少的增加，這可能是由于WPI所含的微量的乳糖與WPI發生了輕微的糖基化反應[12]。WPI與麥芽糖的糖基化產物在420 nm處的吸光值顯著增加，這表明發生了糖基化反應，隨著反應時間的延長及蛋白與糖質量比的降低，吸光值增加，即棕色物質逐漸增多，說明糖基化程度加深。

圖1 反應時間對WPI-麥芽糖色澤的影響

2.2 反應時間對WPI-麥芽糖中游離氨基酸殘留量的影響

圖2為反應時間對不同質量比的WPI-麥芽糖游離氨基酸殘留量的影響。糖基化反應會引起蛋白中游離氨基酸的變化。由圖2可知，在60℃干熱處理120 h的WPI的游離氨基酸殘留量為90%，這可能是因為WPI與乳糖發生了輕微的糖基化反應。糖基化的WPI-麥芽糖中的游離氨基酸殘留量顯著降低，表明WPI與麥芽糖之間發生了交聯。隨著反應時間的延長及蛋白與糖質量比的降低，WPI-麥芽糖中游離氨基酸殘留量逐漸降低，這表明糖基化程度加深。

圖2 反應時間對WPI-麥芽糖游離氨基酸殘留量的影響

2.3 反應時間對WPI-麥芽糖抗原性影響

圖3和圖4為反應時間對不同質量比的WPI-麥芽糖中α-LA和β-LG抗原性的影響。由圖3可知，熱處理WPI中α-LA的抗原性隨時間延長而增加，60℃熱處理120 h時α-LA抗原性增加到196 μg/mL，與無處理的WPI相比，增加了6倍多。蛋白與糖質量比為1～8，糖基化產物中α-LA的抗原性隨蛋白與糖的質量比的下降而下降，但是當蛋白與糖的質量比小于2時，增加糖的用量對α-LA的抗原性影響不大。本研究還測定了將蛋白與糖的質量比為4︰1時α-LA的抗原性，結果與質量比為2︰1的沒有明顯差距，因此在圖3沒有顯示。不同比例的WPI-麥芽糖中α-LA的抗原性隨反應時間的延長變化規律不同，蛋白與糖質量比為8︰1反應120 h內的糖基化產物中α-LA的抗原性隨時間延長而顯著增加；質量比為4︰1反應120 h內的糖基化產物中α-LA的抗原性隨時間延長先略微降低然后升高，反應48 h后高于初始值；質量比為2︰1和1︰1反應120 h內的糖基化產物中α-LA的抗原性基本接近并且都低于初始值。Enomoto[6]研究表明，α-LA與麥芽五糖質量比2︰1，50℃反應72 h α-LA的抗原性略有降低，與本研究相似。

圖3 反應時間對WPI-麥芽糖中α-LA抗原性的影響

圖4 反應時間對WPI-麥芽糖中β-LG抗原性影響

由圖4可以看出，熱處理WPI中β-LG抗原性隨時間延長而增加，60℃熱處理120 h時β-LG抗原性從94 mg/L增加到194 mg/L。蛋白與糖質量比為1～8，糖基化產物中β-LG的抗原性隨蛋白與糖的質量比的下降而下降，這與質量比對α-LA的抗原性的影響相似。蛋白與糖質量比為8︰1和4︰1反應120 h內的糖基化產物中β-LG的抗原性先降低后升高，質量比為4︰1的糖基化產物中β-LG的抗原性始終低于初始值；蛋白與糖質量比為2︰1反應24 h內β-LG抗原性顯著降低，24-120 h隨時間延長逐漸升高；蛋白與糖質量比為1︰1反應24 h內β-LG的抗原性顯著降低，24～120 h內無顯著變化。Hattori[8，9]等將殼聚糖、磷酰基低聚糖、海藻酸低聚糖通過糖基化反應結合到β-LG上，β-LG的抗原性降低的效果不同，與本研究中麥芽糖對β-LG的抗原性的影響也不同，這說明不同的糖對β-LG的抗原性的影響不同。

熱處理WPI中α-LA和β-LG的抗原性隨反應時間延長而增加，布冠好熱處理WPI溶液也得到了相似的結果[14]，這可能是由于蛋白空間結構的展開導致分子內部抗原表位的暴露[13]。WPI-麥芽糖中α-LA和β-LG的抗原性比熱處理WPI中的低，說明糖基化能有效降低熱處理WPI的抗原性，這可能是因為引入的麥芽糖屏蔽了WPI中的抗原表位。由圖1和圖2可知，120 h內糖基化程度隨時間的延長而加深，但是α-LA和β-LG的抗原性并不是逐漸降低，這可能是因為糖基化屏蔽的表位和熱處理暴露的表位同時影響糖基化產物的抗原性，當麥芽糖屏蔽的表位多于熱處理暴露的表位時，抗原性低于初始值，當麥芽糖屏蔽的表位少于熱處理暴露的表位時，抗原性高于初始值。

3 結論

(1)隨著反應時間的延長，WPI-麥芽糖的顏色加深，游離氨基酸殘留量降低，即糖基化程度增加。

(2)在一定條件下，WPI與麥芽糖糖基化能有效降低WPI中α-LA和β-LG的抗原性，WPI-麥芽糖中α-LA和β-LG的抗原性隨蛋白與糖的質量比(1～8范圍內)的下降而下降，反應時間對不同質量比的WPI-麥芽糖中α-LA和β-LG的抗原性的有較大影響。

(2)綜合考慮抗原性低、糖的添加量小和反應時間短3個因素，最適反應條件為蛋白與糖的質量比為2︰1，反應24 h。

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Effect of Glycosylation reaction conditions on the Antigenicity of WPI-Maltose Conjugate

LI Zheng,FENG Li-geng,ZHENG Zhe,LIAO Ping,LUO Yong-kang
(College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Maltose was conjugated to WPI by means of glycosylation to form WPI-maltose.After the protein and sugar of different mass ratio reacting for different time,the antigenicity of α-LA and β-LG were estimated by indirect competition ELISA.The results indicated that the glycosylation of WPI can reduce the antigenicty of α-LA and β-LG.The antigenicity of α-LA can be reduced from 26.2 mg/L to 14.4 mg/L,and the antigenicity of β-LG can be reduced from 95.1 mg/L to 22.4 mg/L.Reaction time have much effect on the antigenicity of α-LA and β-LG in the WPI-maltose of different mass ratio.On condition of the same reaction time,the antigenicity of α-LA and β-LG were declined as the mass ratio of protein and sugar decreased from 8 to 1.

whey protein;maltose;glycosylation;antigenicity

Q936

A

1001-2230（2011）01-0008-04

2010-08-30

國家自然基金資助項目（30471224；30871817）；“十一五”國家科技支撐項目(2006BAD04A06)。

李錚（1986-），女，碩士研究生，研究方向為乳品科學。

羅永康