堿性芽孢桿菌木聚糖酶基因的克隆及表達

陳 娜，生吉萍，申 琳*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

堿性芽孢桿菌木聚糖酶基因的克隆及表達

陳 娜，生吉萍，申 琳*

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

本實驗從廣西紅樹林土壤中篩選出一株產木聚糖酶的耐堿菌HSL38，經過16S rDNA鑒定，其與堿性芽孢桿菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)的同源性達到99%。參考Bacillus halodurans C-125的β-1,4-木聚糖酶基因xynA設計引物，擴增出HSL38中的β-1,4-木聚糖酶基因xyl-BH-G10，其與xynA的同源性達到99%，編碼396個氨基酸殘基(45.27kD)，屬于糖基水解酶GH10家族。將xyl-BH-G10基因與表達載體pET-30a-c(+)連接，構建重組載體，轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導表達重組蛋白。結果表明，在最佳誘導條件下，木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大腸桿菌細胞內高效表達，酶活力達到55.28U/mL，是原菌株HSL38發酵液酶活力的4倍。

堿性芽孢桿菌；木聚糖酶；克隆；表達

木聚糖是植物半纖維素的主要成分，其最終的降解產物是自然界中重要的可再生資源[1]。木聚糖酶是一組可降解木聚糖的水解酶系，主要有β-1,4-木聚糖酶、β-1,4-木糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和酚酶，其中β-1,4-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是木聚糖酶解過程中的關鍵酶[2-4]。木聚糖酶在自然界中分布廣泛，存在于各種真菌、放線菌、細菌、植物、動物瘤胃等環境中，因此不同的木聚糖酶，氨基酸組成差異較大，根據酶催化區域的保守性，木聚糖酶主要歸屬于糖基水解酶GH10族和GH11族，高分子質量酶(大于30kD)多屬于GH10族，低分子質量酶多屬于GH11族[5]。通過分析酶的蛋白結構發現，木聚糖酶由催化區和非催化區組成，其中非催化區包括纖維素結合區、木聚糖結合區、熱穩定區等，決定酶的溫度和pH值穩定性以及底物的專一性[1]。

微生物對木聚糖酶的分泌具有可誘導性，在富含純木聚糖或木聚糖殘渣的培養基中，一些微生物的產酶量會增加，通常在木糖誘導下會促進產酶，在葡萄糖誘導下卻抑制產酶[6]。在工業生產中，木聚糖酶可配合其他水解酶使用，降解植物半纖維素組織，獲得低聚木糖及其下游分解產物資源。因此被廣泛應用于食品加工、飼料生產、制漿造紙、能源工業等行業，具有很大的經濟價值和應用前景[7]。堿性木聚糖酶可用于紙漿漂白工藝，減少環境污染，越來越受到人們的關注，具有廣闊的應用前景[8]。本研究從堿性環境中篩選得到耐堿性強的具有木聚糖酶活性的芽孢桿菌，擴增獲得木聚糖酶基因全序列，并實現了在大腸桿菌中的表達。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤樣品：廣西紅樹林土壤。

限制性內切酶、蛋白質分子質量標準 大連寶生物工程有限公司；Easypfu DNA聚合酶、DNA Marker、T4 DNA連接酶、質粒小量提取試劑盒、細菌總DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；卡那霉素 北京全新拓達公司；樺木木聚糖、SDS、Tris-Base、EDTA、IPTG 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 菌株、質粒及培養基

大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、pEASYBlunt-Simple載體 北京全式金生物技術有限公司；pET-30a-c(+)載體 本實驗室保存。

LB培養基(1L)：10g胰蛋白胨、5g酵母膏、10g NaCl，pH7.0。固體培養基加入1.5%～2.0%瓊脂粉。堿性培養基(1L)：NaCl 20.0g、KH2PO42.0g、MgSO4·7H2O 1.0g、胰蛋白胨5.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖1.0g、瓊脂粉20.0g，121℃滅菌20min；Na2CO310.0g溶于1L水中，過濾滅菌后與上述所配溶液混合。木聚糖酶篩選培養基(1L)：固體LB中加入1%樺木木聚糖。卡那霉素抗性培養基(1L)：LB培養基加入卡那霉素(Kan)，終質量濃度為20mg/L。

1.3 方法

1.3.1 耐堿菌株的篩選

參考吳萍等[9]的方法稍作改變，稱取土壤樣品5g，放入裝有45mL無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的三角瓶中，于水平搖床上振蕩約30min。將梯度稀釋后的菌懸液涂布于堿性培養基上，37℃培養5～7d。劃線純化出單菌落，保存。

將篩選出的耐堿菌點接于木聚糖酶篩選培養基中，37℃培養2d，觀察水解圈。

1.3.2 木聚糖酶活性測定

參考Bailey等[10]的方法測定木聚糖酶活力。取100μL酶液加入900μL 0.5mol/L pH 6.8的Tris-HCl 緩沖液配成的質量濃度為2g/100mL木聚糖溶液，50℃水浴酶解15min。取250μL酶解液，加入750μL DNS，沸水浴反應10min，立即放入冰中冷卻。加入5mL 蒸餾水，混勻，在540nm波長處測吸光度。以沸水浴15min滅活的酶液為對照。酶活力單位(U)：每毫升酶液每分鐘水解木聚糖產生1μmol木糖的量。

1.3.3 細菌總DNA提取及16S rDNA鑒定

使用細菌總DNA提取試劑盒提取總DNA，以總DNA為模板，以27F和1492R為引物PCR擴增細菌16S rDNA[11]。27F：5＇-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT -3＇；1492R：5＇-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT TCA CCC C-3＇。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，共進行30個循環；72℃延伸10min，4℃保溫。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。PCR產物由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.3.4 木聚糖酶基因的克隆

以細菌DNA為模板，參考堿性芽孢桿菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)木聚糖酶基因xynA設計引物。為了避免PCR擴增時出現非特異性條帶，本實驗采用巢式PCR的方法，擴增菌株HSL38的木聚糖酶基因xyl-BH-G10。

在木聚糖酶基因開放式閱讀框(ORF)兩側設計引物F1和F2。反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸2min，共進行30個循環；72℃延伸10min，4℃保溫。切膠回收約2400bp的片段，用作下一步PCR的模板。

使用分別加入酶切位點Bgl Ⅱ和XhoⅠ的引物F3和F4，以第一步PCR后膠回收片段為模板進行第二步PCR。反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，共進行30個循環；72℃延伸10min，4℃保溫。切膠回收約1200bp的片段，取4μL膠回收產物與1μL克隆載體pEASY-Blunt-Simple平末端連接，轉化大腸桿菌DH5α，藍白斑篩選，菌液PCR篩選陽性克隆，由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

表1 巢式PCR引物Table 1 Nested PCR primers

1.3.5 表達載體及大腸桿菌重組子構建

提取重組質粒pEASY-Blunt-Simple-xyl-BH-G10，使用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ雙酶切，膠回收目的片段xyl-BH-G10(約1200bp)。取目的片段與酶切后的載體pET-30a-c(+)于4℃過夜連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，于37℃培養12～16h，菌液PCR篩選陽性重組子。

1.3.6 基因序列分析

基因全長序列及開放閱讀框使用DNAMAN 6.0軟件分析。使用ClustalX、BLAST軟件進行多序列比對。使用ProtParam tool對其分子質量、pI值等進行預測。

1.3.7 大腸桿菌重組子的培養與誘導表達

參考胡春霞等[12]的方法并改進，大腸桿菌重組子經過誘導條件優化，采用0.5mmol/L IPTG，32℃、200r/min誘導6h，表達重組蛋白，并以攜帶空載體pET-30a-c(+)的菌株和未經IPTG誘導的重組菌株為對照。收集超聲波破碎后菌體裂解液上清和沉淀，進行蛋白電泳分析。

1.3.8 重組蛋白活性分析及其酶活測定

蛋白電泳[13]和活性電泳分析[14]：在分離膠中加入0.5g/100mL的木聚糖，進行SDS-PAGE。電泳結束后，使用25%異丙醇溶液于脫色搖床上振蕩膠塊30min，再使用0.5mol/L pH6.8的Tris-HCl緩沖液于4℃浸泡4次，每次30min，于50℃水浴反應1h，0.1g/100mL的剛果紅染色30min，加入0.5%醋酸溶液，膠片觀察燈下觀察水解圈。

分別測定經IPTG誘導的重組菌株E.coli pET-30a-c(+)-xyl-BH-G10裂解液上清及菌株HSL38在37℃、200r/min發酵12h后上清液的酶活力，并以攜帶空載體的菌株和未經IPTG誘導的重組菌株裂解液酶活力為對照。各菌株均接種3瓶，分別收集酶液測定酶活力，用Excel 2007軟件分析數據，計算標準偏差并制圖。

2 結果與分析

2.1 耐堿菌株的篩選及鑒定

堿性培養基pH值范圍為10.5～11.0，利用其篩選出耐堿性的微生物。將篩選所得耐堿微生物接種于木聚糖酶篩選培養基中，篩選得到具有木聚糖酶活性的菌株HSL38。16S rDNA鑒定與堿性芽孢桿菌Bacillus halodurans同源性達99%。初步鑒定菌株HSL38屬于Bacillus halodurans。

2.2 木聚糖酶基因的擴增及序列分析

圖1 xyl-BH-G10基因的PCR產物Fig.1 Electrophorogram of PCR amplified product of xyl-BH-G10 gene

根據菌株HSL38 16S rDNA鑒定結果，以Bacillus halodurans C-125的木聚糖酶基因xynA為參考，設計巢式PCR引物，進行擴增，最終得到約1200bp的片段，與xynA基因大小相符，結果見圖1。

將基因xyl-BH-G10的PCR產物切膠回收，與克隆載體pEASY-Bunt-Simple進行平末端連接，藍白斑篩選，獲得陽性克隆，并測序，結果見圖2。

基因xyl-BH-G10 與Bacillus halodurans C-125的xynA基因同源性達到99%，蛋白序列一致，編碼396個氨基酸殘基，屬于糖基水解酶GH10家族。根據劉亮偉等[15]對木聚糖酶分子進化的研究表明，GH10家族的木聚糖酶從生物進化方面來看，其來源于高溫環境；從三維結構來看，其結構為(β/α)8折疊桶，可結合更小的底物，產物中單糖較多。因此推測木聚糖酶xyl-BH-G10的溫度穩定性較高，分解底物較徹底。利用ProtParam tool預測其蛋白質分子質量為45.27kD，pI值為4.66，融合His標簽的重組蛋白分子質量為49.31kD。

2.3 重組表達載體的構建和轉化

提取質粒pEASY-Blunt-Simple-xyl-BH-G10和質粒pET-30a-c(+)，使用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ雙酶切質粒，分別切膠回收約1200bp(xyl-BH-G10)和約5400bp(pET-30a-c(+)線性載體)，在T4 DNA連接酶的作用下，4℃過夜連接。連接產物轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，菌液PCR鑒定為陽性菌株。

圖3 重組載體及其酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid and restriction digestion

2.4 木聚糖酶基因xyl-BH-G10的表達

以帶有空載體的菌株E.coli BL21(DE3)-pET-30a-c(+)和未誘導的菌株E.coli BL21(DE3)-pET-30a-c(+)-xyl-BH-G10為對照。經誘導表達后，收集菌體裂解上清液，進行SDS-PAGE電泳，結果見圖4。

圖4 重組大腸桿菌菌株裂解液SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of cell lysate of recombinant E. coli

從蛋白電泳可以看出，基因xyl-BH-G10在大腸桿菌中發生了截斷表達，可能是由于蛋白水解酶將蛋白降解，也可能因為出現了新的翻譯起始點[16]。分析基因xyl-BH-G10的序列，發現在+90處存在RBS(核糖體結合位點)AGGAGG，通過GENSCAN在線分析軟件(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)找出其開放式閱讀框，并預測其分子質量為34.92kD，可能是木聚糖酶成熟蛋白。圖4顯示，在預測木聚糖酶成熟蛋白約35kD處有明顯的蛋白條帶，在約49kD處的蛋白條帶，大小與加了His標簽的木聚糖酶重組蛋白相似。并且，攜帶空載體的菌株在約35kD和約49kD處無蛋白表達，未經誘導的菌株有微量的本底表達。同時，從裂解液沉淀處的蛋白條帶可以看出，在本實驗的誘導表達條件下有部分包含體形成。于是，進一步進行活性電泳驗證重組蛋白活性。

2.5 重組蛋白活性分析及其酶活力

圖5 重組大腸桿菌菌株裂解液SDS-PAGE和活性電泳Fig.5 SDS-PAGE and native gel electrophoresis of cell lysate of recombinant E. coli

利用活性電泳驗證重組蛋白的酶學活性，結果如圖5所示。從木聚糖酶活性電泳看出，約35kD和約49kD處的蛋白均具有木聚糖酶活性，初步驗證基因xyl-BH-G10所表達的蛋白及加了His標簽的重組蛋白均具有木聚糖酶活性。進一步使用DNS法測定木聚糖酶活性，結果見表2。

表2 重組大腸桿菌和菌株HSL38木聚糖酶酶活力Table 2 Xylanase activities of recombinant E. coli and original HSL38 strain

從表2可以看出，在最佳誘導條件下，木聚糖酶基因xyl-BH-G10在大腸桿菌細胞內高效表達，酶活達到55.28U/mL，是原菌株HSL38發酵液酶活的4倍。

3 結 論

本研究從紅樹林土壤中篩選出具有木聚糖酶活性的耐堿性菌株HSL38，并根據已有數據庫資源克隆出該菌株的木聚糖酶基因xyl-BH-G10，對其進行原核表達，酶活力達到55.28U/mL，是原菌株HSL38發酵液酶活力的4倍。通過對xyl-BH-G10基因進行序列比對發現，該基因與堿性芽孢桿菌Bacillus halodurans C-125(GenBank：NC_002570.2)β-1,4-木聚糖酶基因xynA的同源性達到99%，蛋白序列一致。同時，通過蛋白電泳和活性電泳發現，在本實驗條件下，該基因在大腸桿菌中出現截斷表達現象，但這不影響對基因功能的驗證。根據梁艷麗等[17]的研究發現，xynA基因表達的蛋白，在pH4.5～9.0的條件下均有酶活力。Nishimoto等[18]研究堿性芽孢桿菌Bacillus halodurans C-125的堿性木聚糖酶XynA發現其活性中心的不同的質子供體氨基酸會影響到酶的pH值穩定性。通過研究蛋白結構探索不同來源木聚糖酶的酶學性質，并且定向進化木聚糖酶基因[19]，或者利用異源表達，構建基因工程菌[20]，成為今后木聚糖酶研究的方向。

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Cloning and Expression of Xylanase Gene from Alkaliphilic Bacillus halodurans

CHEN Na，SHENG Ji-ping，SHEN Lin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In this study, an alkaliphilic strain (HSL38) producing xylanase was isolated from mangrove soil, and identified as Bacillus halodurans C-125 (GenBank: NC_002570.2) based on 16S rDNA analysis, which revealed a similarity of 99%. Specific primers based on theβ-1,4-xylanase gene xynA of Bacillus halodurans C-125 were designed, and theβ-1,4-xylanase gene (xyl-BH-G10) from HSL38 strain was amplified. Sequence analysis showed 99% similarity between the xynA gene and the amplified gene encoding a precursor of 396 amino acid residues (45.27 kD), which belonged to glycoside hydrolase family 10 GH10. A recombinant expression plasmid was constructed by linking xyl-BH-G10 to the expression plasmid pET-30a-c(+), and then transformed into E. coli BL21(DE3). The expression of recombinant protein was achieved under IPTG induction. These investigations indicated that theβ-1,4-xylanase gene xyl-BH-G10 was highly expressed in E. coli BL21 (DE3) cells under the optimal induction conditions, and an xylanase activity of 55.28 U/mL was obtained, which exhibited a 4-fold enhancement when compared to the fermentation of original HSL38 strain.

Bacillus halodurans；xylanase；cloning；expression

Q786

A

1002-6630(2011)05-0234-05

2010-09-26

國家公益性行業(農業)科研專項(200803033)

陳娜(1985—)，女，碩士研究生，主要從事食品生物技術研究。E-mail：chenna0419@126.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，副教授，博士，主要從事果蔬采后病理與農副產品資源綜合利用研究。

E-mail：shen5000@gmail.com