山核桃殼棕色素的生物活性及其紅外光譜分析

陳 曉，葉 明,*，陳 煒，楊 柳，方 勇，詹權勝

(1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽詹氏食品有限公司，安徽 寧國 242300)

山核桃殼棕色素的生物活性及其紅外光譜分析

陳 曉1，葉 明1,*，陳 煒1，楊 柳1，方 勇2，詹權勝2

(1.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽詹氏食品有限公司，安徽 寧國 242300)

用體積分數95%乙醇提取山核桃殼棕色素，經AB-8大孔樹脂純化后，對其生物活性及紅外光譜進行研究。結果表明：質量濃度為3.0g/L時，山核桃殼棕色素的總抗氧化能力相當于126.65mmol/L α-生育酚；棕色素還原能力的EC50值(吸光度為0.5時的質量濃度)為0.286g/L；質量濃度為1.0g/L時，棕色素對·OH的清除率達到60.84%。抑菌實驗表明：山核桃殼棕色素對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)均有抑制作用，最低抑菌濃度分別為0.125、0.25、0.25、1.0、0.5g/L。紅外光譜分析結果表明：該棕色素含有苯環和酚羥基結構。

山核桃殼；棕色素；生物活性；最低抑菌濃度

山核桃(Carya cathayensis)屬胡桃科、胡桃屬植物，分布于亞、歐、美等大洲[1-2]，其中我國的山核桃主要產于浙皖交界的天目山區[3]。山核桃果仁風味獨特，富含不飽和脂肪酸、蛋白質、礦質元素和維生素等，具有很高的營養價值和保健功能，而山核桃殼作為廢棄物，目前大多被用作農戶燃料和制備活性炭，利用度較低。

近年來學者們對山核桃殼、葉片等進行了研究，其中山核桃葉片和外果皮的提取物具有明顯的抑菌作用[4-5]，山核桃外蒲殼提取物對食用油脂具有明顯的抗氧化作用[6]，山核桃青果提取物對DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有很強的清除作用，并對HL-60人類骨髓性白血病具有細胞毒性[2]，然而對山核桃殼棕色素的生物活性及結構卻關注甚少。本實驗采用體積分數95%乙醇溶液對山核桃殼棕色素進行浸提，經大孔樹脂純化后對該棕色素的抗氧化活性、抑菌活性和紅外光譜進行研究，為山核桃殼棕色素在食品與醫藥中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、供試菌株與試劑

山核桃殼由安徽省寧國市詹氏食品有限公司提供。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger)由合肥工業大學微生物資源與應用研究室分離保藏。

AB-8大孔樹脂 天津光復精細化工研究所。

1.2 山核桃棕色素的提取[7]

稱取10g粉碎至60目的山核桃殼，加入50mL石油醚，25℃、180r/min振蕩12h，以除去油脂、臘質等。重復兩次，合并濾渣，干燥稱質量。取一定量處理后的山核桃殼，用95%乙醇溶液，料液比為1:10，于80℃水浴回流4h。過濾，濾渣用等量溶劑同法再提取一次，合并濾液，旋轉蒸發儀蒸至無醇味，定容至一定體積備用。

1.3 山核桃棕色素的純化與鑒定

[8]方法進行單因素試驗，最終選用AB-8大孔樹脂對山核桃殼棕色素進行純化(層析柱規格為16mm×60cm，濕法裝柱，柱高40cm)。取50mL棕色素溶液進行動態吸附，控制流速為1mL/min，用60%乙醇進行洗脫，洗脫過程重復兩次。收集洗脫液，旋轉蒸發儀蒸至無醇味后得到山核桃棕色素純品，用蒸餾水定容。取少量棕色素溶液，用SP-1901紫外-可見分光光度計在波長200～400nm范圍內掃描。

1.4 山核桃殼棕色素的抗氧化活性

1.4.1 總抗氧化能力的測定

參考文獻[9]方法并略作修改。0.3mL不同質量濃度樣品溶液及3mL反應溶液(含0.6mol/L的硫酸、28mmol/L磷酸鈉溶液及4mmol/L的鉬酸銨溶液)放入具塞試管中，90℃水浴保溫90min，冷卻至室溫后，于695nm波長處測吸光度(A)。空白管以0.3mL蒸餾水代替樣品溶液。總抗氧化能力以當量α-生育酚表示，α-生育酚標準曲線為：A=0.011c+0.0049(R2=0.987)，式中A為695nm波長處的吸光度，c為α-生育酚的當量濃度(mmol/L)。

1.4.2 還原能力的測定

參考文獻[10]方法進行。

1.4.3 清除·OH能力的測定

參考文獻[11]方法進行。

1.5 山核桃殼棕色素的抑菌活性

1.5.1 菌懸液的制備

上述供試菌種活化后，以無菌水制成含菌數約為1×105CFU/mL菌懸液。

1.5.2 抑菌活性

采用紙片擴散法[12]。分別取不同供試菌的菌懸液各0.1mL，均勻涂布在營養瓊脂平板上，室溫干燥5min，將經滅菌后的濾紙片平放于無菌平皿內每片滴加不同質量濃度棕色素溶液20μL，室溫自然晾干，用無菌鑷子取樣片輕輕貼放于平板表面。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌于37℃培養20h，黑曲霉和酵母菌于28℃培養48h后，觀察并測量抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑大小來衡量抑菌效果。無菌水作為對照。每個樣品設3個平行樣。

1.5.3 最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用二倍稀釋法測最低抑菌濃度[13]。將山核桃殼棕色素溶液加入液體培養基中，使各管色素溶液波長處質量濃度分別為1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625g/L，然后將1×105CFU/mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和釀酒酵母接種于各試管中，培養箱內相應溫度恒溫培養 24h后，完全無菌生長的最高稀釋度即為最低抑菌濃度。

1.6 山核桃殼棕色素的紅外光譜測定

稱取純化的干燥棕色素2mg與400mg KBr混勻，在瑪瑙缽體中研磨5～l0min，壓片，在FT-IR6700傅里葉變換紅外光譜儀上4000～400cm-1區間測定紅外光譜。

2 結果與分析

2.1 山核桃殼棕色素的鑒定

圖1 山核桃殼棕色素的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum of brown pigment from hickory shell

由圖1可知，山核桃殼棕色素在紫外區吸光度隨波長的增大而增大，在波長240nm處吸光度達到最大值。

2.2 山核桃殼棕色素的抗氧化活性

圖2 山核桃殼棕色素的總抗氧化性Fig.2 Dose-effect relationship of total antioxidant activity of brown pigment from hickory shell

2.2.1 山核桃殼棕色素的總抗氧化性α-生育酚是一種應用較為廣泛的抗氧化劑，通過與其比較來反映山核桃殼棕色素的總抗氧化能力的大小。由圖2可知，山核桃殼棕色素總抗氧化能力隨質量濃度的增加而增大，并呈現出良好的量效關系：y=39.312x+8.4407(R2=0.9987)。質量濃度為3.0g/L時，山核桃殼棕色素的總抗氧化能力相當于126.65mmol/L α-生育酚。

2.2.2 山核桃殼棕色素的還原能力

圖3 山核桃殼棕色素的還原能力Fig.3 Reducing power of brown pigment from hickory shell at various concentrations

由圖3可知，山核桃殼棕色素的還原能力隨著質量濃度增加而呈上升趨勢，并且具有良好的量效關系：y=0.3288x+0.4059(R2=0.969)。質量濃度為1.0g/L時，山核桃殼棕色素的還原能力超過0.1g/L VC的還原能力；該棕色素的EC50值(吸光度為0.5時的質量濃度)為0.286g/L。2.2.3 山核桃殼棕色素對·OH的清除作用

圖4 山核桃殼棕色素清除·OH效果Fig.4 Hydroxyl free radical scavenging rates of brown pigment from hickory shell at various concentrations

由圖4可知，山核桃殼棕色素對·OH具有很強的清除能力，并隨著質量濃度的增加，清除率呈上升趨勢。當質量濃度為1.0g/L時，山核桃殼棕色素對·OH的清除能力與0.3g/L VC 體系的清除能力相近，此時清除率為60.84%。

2.3 山核桃殼棕色素的抑菌活性

由表1可知，山核桃殼棕色素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母、黑曲霉均有抑制效果，隨著質量濃度的增加，其抑菌效果呈上升趨勢。當質量濃度達到5g/L時，山核桃殼棕色素對5種菌的抑菌圈直徑分別為(15.09±0.03)、(18.87±0.03)、(9.10±0.03)、(24.89±0.03)、(13.07±0.02)mm。山核桃殼棕色素對釀酒酵母抑制作用最大，其次為枯草芽孢桿菌，對大腸桿菌抑制作用稍弱。

表1 山核桃殼棕色素的抑菌作用Table 1 Antimicrobial ring diameters of brown pigment from hickory shell at various concentrations against five microorganisms

2.4 山核桃殼棕色素的最低抑菌濃度

表2 山核桃殼棕色素的最低抑菌濃度Table 2 MICs of brown pigment from hickory shell against five microorganisms

由表2可知，山核桃殼棕色素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母和黑曲霉5種菌的最低抑菌濃度分別為0.25、0.25、1.0、0.125、0.5g/L。表明山核桃殼棕色素抗菌譜較廣。

2.5 山核桃殼棕色素的紅外光譜分析

圖5 山核桃殼棕色素的紅外光譜Fig.5 IR spectrum of brown pigment from hickory shell

由圖5可見，山核桃殼棕色素的主要吸收波峰在3427.03、1613.62、1516.75、1450.05、1282.16、1117.73、653.96cm-1處。在1613.62cm-1處有芳環骨架振動引起的較強吸收峰； 1117.73cm-1和1282.16cm-1顯示C－O伸縮振動和C－O－H面內彎曲振動；在890～620cm-1范圍內的吸收帶很弱，表明芳環被取代，形成共軛體系，芳氫相對含量較少；3427.03cm-1處存在強的共振吸收峰，是由O－H的伸縮振動產生的。

3 結 論

通過總抗氧化能力，還原力以及清除羥自由基能力評價山核桃殼棕色素的抗氧化活性，結果表明：山核桃殼棕色素具有較強的抗氧化能力，對供試的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母、黑曲霉均有不同程度的抑制作用。紅外光譜結果表明：山核桃殼棕色素含有苯環和酚羥基結構，其中酚羥基具有很強的提供質子的能力，能與更多的自由基結合[14-15]，這在一定程度上也說明了山核桃殼棕色素清除自由基活性與其結構的相關性。

參考文獻：

[1] 黎章矩. 山核桃栽培與加工[M]. 北京: 中國農業科學出版社, 2003.

[2] LIU Lijuan , LI Wei, SASAKI T, et al. Juglanone, a novel a-tetralonyl derivative with potent antioxidant activity from Juglans mandshurica[J]. Journal of Natural Medicines, 2010, 64 (4): 496-499.

[3] 郭傳友, 黃堅欽, 方炎明. 山核桃研究綜述及展望[J]. 經濟林研究,2004, 22(1): 61-63.

[4] 殷舒, 毛勝鳳, 楊瓊霞, 等. 山核桃葉片提取物的抑菌作用[J]. 浙江林學院學報, 2007, 24(5): 604-607.

[5] 蘇秀, 馬良進, 陳安良, 等. 山核桃外果皮提取物抑菌活性的初步研究[J]. 浙江林學院學報, 2008, 25(3): 355-358.

[6] 陳向明, 王華苓, 馬芹芬. 山核桃外蒲殼提取物對食用油脂的抗氧化性研究[J]. 中國糧油學報, 2007, 22(6): 109-112.

[7] 吳楠, 王微, 夏瑩瑩, 等. 紅松針葉乙醇提取物與水提物的抗菌活性研究[J]. 食品科學, 2008, 29(11): 80-83.

[8] 李維莉, 馬銀海, 劉增康, 等. 核桃殼棕色素的提取及性質研究[J].食品科學, 2008, 29(12): 339-341.

[9] BOUGATEF A, HAJJI M, BALTI R, et al. Antioxidant and free radicalscavenging activities of smooth hound(Mustelus mustelus) muscle protein hydrolysates obtained by gastrointestinal proteases[J]. Food Chemistry, 2009, 114: 1198-1205.

[11] 葉明, 陳曉, 朱立, 等. 暗盤孢屬YM421黑色素穩定性及其抗氧化活性[J]. 菌物學報, 2010, 29(2): 254-260.

[12] ESPINEL-INGROFF A, WHITE T, PFALLER M A. Manual of clinical microbiology[M]. Washington DC: American Society for Microbiology,1999: 1640-1652.

[13] BULET P, COCIANCICH S, DIMARCQ J L, et al. Isolation froma coleopteran insect of a novel inducible antibacterial peptide and of new members of the insect defensin family[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1991, 266(36): 24520-24525.

[14] HUSAIN S R, CILLARD J, CILLARD P. Hydroxyl radical scavenging activity of flavonoids[J]. Phytochemistry, 1987, 26(9): 2489-2491.

[15] 陳琪, 王伯初, 唐春紅, 等. 黃酮類化合物抗氧化性與其構效的關系[J]. 重慶大學學報, 2003, 26(11): 48-51.

Antioxidant and Antimicrobial Activities and Infrared Spectroscopic Analysis of Brown Pigment from Hickory Shell

CHEN Xiao1，YE Ming1,*，CHEN Wei1，YANG Liu1，FANG Yong2，ZHAN Quan-sheng2
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Anhui Zhanshi Food Co. Ltd., Ningguo 242300, China)

Brown pigment extracted from hickory shell with 95% alcohol and purified on AB-8 macroporous resin column was subjected to evaluation of antioxidant and antimicrobial activities and infrared spectroscopic analysis. The results showed that the total antioxidant capacity of the brown pigment at a concentration of 3.0 g/L was equivalent to 126.65 mmol/L α-tocopherol.The EC50 value (the effective concentration at which the absorbance was 0.5) of reducing power for the pigment was 0.286 g/L.The scavenging rate against hydroxyl free radicals reached 60.84 % at 1.0 g/L. The MIC (minimum inhibitory concentration)values of antibacterial effects on Saccharomyces cerevisiae, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli and Aspergillus niger were 0.125, 0.25, 0.25, 1.0 g/L and 0.5 g/L, respectively. IR spectral analysis revealed the presence of benzene ring and phenolic hydroxyl in the pigment.

hickory shell；brown pigment；biological activities；minimum inhibitory concentration

TS264.4

A

1002-6630(2011)05-0115-04

2010-06-30

安徽省科技攻關計劃重大項目(09010301022)

陳曉(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品資源綜合利用。E-mail：chenxiao198525@126.com

*通信作者：葉明(1959—)，男，教授，博士，研究方向為生物資源綜合利用。E-mail：yeming123@sina.com