2010年能力驗證盲樣樣品細菌內毒素檢查方法的建立

北京市海淀區藥品檢驗所（100083）楊帆

本研究參照《中國藥典》2005年版第二部中“細菌內毒素檢查法”試驗的基本原理和細菌內毒素檢查干擾/確證試驗的設計[1][2]，建立細菌內毒素檢查的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 盲樣凍干粉（70-A；70-B；70-C）。細菌內毒素工作標準品批號：150601-200862，規格：120 EU/ml，由中國藥品生物制品檢定所提供。鱟試劑批號：0904230，裝量：0.1ml/支，靈敏度：0.25EU/ml，由湛江博康海洋生物有限公司提供。細菌內毒素檢查用水（BET水）批號：090511，裝量：2ml/支，由湛江博康海洋生物有限公司提供。ZH-Z型自動旋渦混合器，由天津市天大天發科技有限公司提供。HHSIINII型電熱恒溫水浴箱，由上海躍進醫療器械廠提供。

1.2 細菌內毒素理論限值（L）的計算 樣品在實驗前需用1ml細菌內毒素檢查用水復溶，3份樣品根據能力驗證計劃作業指導書設定的細菌內毒素限值均為“應小于50EU/ml。

1.3 鱟試劑靈敏度（λ）復核試驗 按照《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE細菌內毒素靈敏度復核項下進行試驗[1]，結果所用鱟試劑靈敏度均在0.5～2.0λ范圍內，符合規定，可用于本試驗。

1.4 干擾試驗 最大有效稀釋倍數（MVD）的計算。盲樣樣品的內毒素限度值設定L＝50EU/ml，且濃度為1ml/ml，對應于靈敏度λ=0.25 EU/ml的鱟試劑，注射用環磷腺苷內毒素檢測最低有效稀釋倍數為MVD=c×L/λ=200。

1.5 供試品的細菌內毒素檢查試驗 根據干擾試驗結果，選擇200倍稀釋后的供試品液試驗。然后用λ=0.25EU/ml的鱟試劑試驗，并設供試品陽性對照（2λ）、陰性對照和陽性對照（2λ）。再取λ=0.25EU/ml的鱟試劑16支，分別用0.1 ml BET水溶解，再加入配制好的供試品稀釋液0.1ml，每種藥液平行做2管，37℃保溫，60min后觀察結果。

2 試驗結果

2.1 鱟試劑靈敏度（λ）復核試驗 試驗結果表明，復核靈敏度λc=λ，鱟試劑靈敏度標示符合規定。見附表1。

附表1 鱟試劑標示靈敏度復核試驗

2.2 干擾試驗結果 各濃度對鱟試劑均無干擾，因其理論稀釋倍數為200倍，所以確定供試品濃度0.25EU/ml為最終有效稀釋濃度。見附表2。MVD=c×L/λ=1×50/0.25=200（倍）。

2.3 確證試驗結果 當內毒素標準溶液的Es值在0.5～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）時，而供試品的Et值在0.5～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）時，即無干擾作用。反之，則有。供試品的濃度在0.25EU/ml時，對以上3個樣品的鱟試劑均未產生干擾作用。結果見附表2。

2.4 供試品的細菌內毒素檢查試驗 本試驗條件下，按細菌內毒素檢查法應用指導原則進行試驗，可以用稀釋方法排除干擾；對供試品用細菌內毒素檢查法進行檢測。

2.5 供試品檢查

2.5.1 溫度控制 實驗前接通恒溫儀電源，溫度調至（37+1）℃。

2.5.2 細菌內毒素溶液制備

2.5.3 供試品陽性對照溶液的制備 分別取0.5ml 2倍濃度的供試品+0.5ml 4λ的內毒素制成混合均勻的供試品陽性對照溶液，備用。

2.5.4 鱟試劑的準備 取鱟試劑16支，0.1ml/支，按標示量加入BET用水復溶，備用。

2.5.6 試驗加樣 結果見附表3。

2.5.7 供試品細菌內毒素檢查結果 見附表4。

3 結論

本研究結果表明，盲樣70-B、70-C的細菌內毒素含量小于理論限值50EU/ml，70-A的細菌內毒素含量大于理論限值50EU/ml。

附表2 鱟試劑標示靈敏度復核試驗結果

附表3 試驗加樣表（ml）

附表4 供試品細菌內毒素檢查結果

4 討論

4.1 由于細菌內毒素檢查法操作簡單、靈敏度高、重現性好，快速、方便，一次可檢查多批檢品，使用性強，故用本方法來檢查細菌內毒素含量，達到安全用藥的目的。

4.2 本文先通過干擾試驗確定供試品的有效稀釋濃度，再由確證試驗進一步修整，以減少干擾試驗的盲目性，避免浪費試劑，節省時間。鱟試劑要求的pH值范圍和其他因素可以通過稀釋來排除干擾[3][4]。

4.3 假陽性或高陽性的原因：①所用試管、針頭、注射器未完全消除熱原。②溶解鱟試劑時，用力太大，產生較多泡沫，產生假陽性。③操作環境污染。④鱟試劑的靈敏度不符合規定，易呈現高陽性。⑤由于凝聚反應是不可逆的，所以在恒溫反應過程及觀察結果時，應注意不要使試管受到振動，以免使凝膠破碎產生假陰性。⑥每次稀釋倍數不得超過10倍。