肉中4種致病菌的P C R快速檢測方法的建立

劉紅玉，李 巖，崔洪斌

(1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，黑龍江 哈爾濱 150086)

肉中4種致病菌的P C R快速檢測方法的建立

劉紅玉1，李 巖1，崔洪斌2

(1.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，黑龍江 哈爾濱 150086)

目的：建立一種能同時檢測肉中金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌的多重PCR檢測方法。方法：根據金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)、沙門氏菌的侵襲蛋白基因(invA)、志賀氏菌的侵襲性質?？乖?ipaH)和單核細胞增生性李斯特菌的內化素基因(inlA)設計引物，通過優(yōu)化好的反應體系進行多重聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的基因。結果：特異性實驗結果表明4種菌均能在相應位置擴增出特異性條帶。對污染4種菌的豬肉進行檢測，確定出金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的檢出限是102CFU/mL，志賀氏菌和單核增生李斯特菌的檢出限是101CFU/mL。結論：本實驗建立的多重PCR方法比傳統(tǒng)細菌檢測方法更特異、快速、靈敏，適用于肉中金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門菌和單核增生李斯特菌的快速檢測。

多重聚合酶鏈反應(PCR)；致病菌；肉；檢測

食源性致病菌是引起食源性疾病的重要原因，食源性疾病可以侵犯任何人群，兒童、孕婦、年老體弱者和免疫力低下的人群更容易感染食源性疾病，成為最主要的受害人群[1]，因此加強食品中致病微生物的檢測技術研究具有重要的現實意義。傳統(tǒng)檢測方法檢測時間長、程序繁瑣，已無法滿足快速檢測的要求。近幾年常用的食源性致病菌的PCR檢測方法已被建立起來，如金黃色葡萄球菌[2]、志賀氏菌[3]、沙門氏菌[4]單核細胞增生李斯特氏菌[5]和大腸桿菌等，但是單一致病菌的PCR檢測技術和一般方法顯然都不能滿足對大批食品進行致病菌快速檢測的需要，針對這種情況，建立了同時檢測多種致病菌的多重PCR技術，并且這種技術已經有了很大發(fā)展[6]。本研究以金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)、沙門氏菌的侵襲蛋白基因(invA)、志賀氏菌的侵襲性質?？乖?ipaH)和單核細胞增生性李斯特菌的內化素基因(inlA)作為研究對象，建立一種靈敏性高、特異性好且穩(wěn)定的多重PCR體系，對快速、準確的一次性檢測肉中4種致病菌感染狀況進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌標準株由黑龍江大學生命科學學院提供；新鮮豬肉 市購。

細菌基因組DNA試劑盒、dNTPs、DNA Marker DL2000 北京百泰克生物技術有限公司；EZgeneTMTissue gDNA Kit(BIOMIGA)；10 × buffer(Mg2+Plus)、6×buffer、Taq酶 大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖 西班牙Biowest公司；50×TAE；Tris-HCl；EB；無水乙醇；TGRADIENT型PCR儀 德國Biometra公司；DYY-III型電泳儀 北京六一儀器廠；BTS-20.M凝膠成像系統(tǒng) 英國Uvitec公司。

擴增的目的基因及引物設計：選擇金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因[7-8](nuc)、沙門氏菌的侵襲蛋白基因[9-10](invA)、志賀氏菌的侵襲性質?？乖騕11-12](ipaH)和單核細胞增生性李斯特菌的內化素基因[13-14](inlA)作為目的基因，用Primer 5分析軟件設計4對特異性引物，由金思特(南京)有限公司合成(表1)。

表1 擴增的目的基因及引物設計Table 1 Target genes and corresponding primer sequences

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng)

在5mL新鮮無菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。

1.2.2 細菌基因組DNA的制備

根據細菌基因組DNA試劑盒說明書進行。

1.2.3 多重PCR擴增

對引物添加量、dNTPs添加量、退火溫度、PCR循環(huán)數進行優(yōu)化，確定最適反應體系。最終確定反應體系為50μL：10×buffer(Mg2+Plus)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)5μL，上、下游引物(10mmol/L)各2μL，模板4μL，Taq酶1μL，其余用雙蒸水補足至50μL。PCR擴增程序：采用熱啟動。95℃預變性5min；94℃變性30s；56℃退火45s；72℃延伸 1min；進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。

1.2.4 特異性檢測

1.2.4.1 引物特異性檢測

從金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、單核增生李斯特菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中提取DNA進行PCR擴增檢測引物特異性。

1.2.4.2 反應特異性檢測

將金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌隨機進行組合，提取DNA進行多重PCR擴增檢測多重PCR反應特異性。

1.2.5 靈敏度檢測

將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌的單一菌液和4種菌的混合菌液分別用無菌的生理鹽水10倍稀釋，使4種菌的濃度均依次為107～100CFU/mL。根據細菌基因組DNA試劑盒說明書進行，提取的DNA作為多重PCR反應的模板。檢測單一致病菌的靈敏度和同時檢測4種致病菌的靈敏度。

1.2.6 多重PCR反應產物檢測

取5μL PCR反應產物在3%瓊脂糖凝膠上進行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并成像。

1.2.7 多重PCR檢測人工污染的肉樣

挑選25g放入無菌樣品袋內，加入225mL生理鹽水，均質后，取出部分清液加入到滅菌營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基里，37℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌混合培養(yǎng)液，10倍稀釋，使?jié)舛纫来螢?07～100CFU/mL，分別接種于2.5g肉糜上，根據EZgeneTMTissue gDNA Ki說明書進行，提取DNA作為多重PCR模板。利用已經建立的多重PCR反應程序進行檢測，取5μL PCR產物在3% 瓊脂糖凝膠上進行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并成像，確定4種致病菌在豬肉中的檢測限。

2 結果與分析

2.1 特異性檢測

2.1.1 多重PCR引物特異性檢測

目標菌株僅對其對應引物有特異性反應，在相應位置出現了特征條帶，而對其他菌的引物沒有擴增現象(圖 1)。

圖1 多重PCR引物特異性Fig.1 Specificity of multiplex PCR primers

圖1顯示，金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌和單核增生李斯特菌均為陽性結果，均能在相應位置擴增出特異性條帶；其他的菌為陰性結果，沒有擴增出特異性條帶；因此該引物特異性較強。

2.1.2 多重PCR反應特異性檢測

將4種致病菌隨機組合，進行多重PCR反應特異性檢測(圖 2)。

圖2 多重PCR反應特異性Fig.2 Specificity of multiplex PCR reaction

由圖2可知，多重PCR反應均能特異性的擴增出目的片段。由此可知，該多重PCR方法特異性強，可同時檢測4種食源性致病菌的一種或幾種。

2.2 多重PCR反應的靈敏度檢測

2.2.1 多重PCR檢測單一致病菌的靈敏度

將初始濃度均為107CFU/mL的4種菌分別10倍梯度稀釋，提取的DNA作為PCR反應模板，確定多重PCR檢測單一致病菌的靈敏度。由圖3可知，多重PCR檢測4種單一致病菌的靈敏度均為101CFU/mL。

圖3 多重PCR分別檢測金黃色葡萄球菌(A)、沙門氏菌(B)、志賀氏菌(C)、單核增生李斯特菌(D)的靈敏度Fig.3 Sensitivity of multiplex PCR detection forStaphylococcus aureus(A),Salmonellaspp. (B),Shigellaspp. (C) andListeria monocytogenes(D)

2.2.2 多重PCR同時檢測4種致病菌靈敏度

初始濃度為107CFU/mL的4種混合菌液梯度稀釋，提取的DNA作為多重PCR反應模板，確定多重PCR同時檢測4種致病菌的靈敏度(圖4)。

圖4 多重PCR同時檢測4種致病菌的靈敏度Fig.4 Sensitivity of multiplex PCR detection for four pathogens in meat

由圖4可知，多重PCR同時檢測4種致病菌的靈敏度為金黃色葡萄球菌為102CFU/mL、志賀氏菌為101CFU/mL、沙門氏菌為102CFU/mL、單核增生李斯特菌為101CFU/mL。

2.3 人工污染肉確定檢出限

從肉中提取的DNA按照優(yōu)化好的條件多重PCR擴增，擴增結果見圖5。

圖5 豬肉中4種致病菌多重PCR檢測Fig.5 Multiplex PCR detection of four bacterial pathogens in meat

由圖5可知，豬肉中多重PCR同時檢測4種致病菌的靈敏度為金黃色葡萄球菌為102CFU/mL、志賀氏菌為101CFU/mL、沙門氏菌為102CFU/mL、單核增生李斯特菌為101CFU/mL。

3 討 論

研究發(fā)現，多重PCR的優(yōu)化主要是優(yōu)化引物的合適配比、dNTP量、MgCl2濃度、退火溫度和循環(huán)次數。在本實驗中10×buffer中帶Mg2+(15mmol/L)，加入5μL的10×buffer后，體系中的Mg2+相當于最適添加量，所以沒有優(yōu)化。只對引物添加量、dNTP量、退火溫度和循環(huán)次數進行了優(yōu)化，從中確定最適添加量。本研究的多重PCR技術具有很高的特異性，在很大程度上簡化了操作步驟，節(jié)省了試劑，并縮短了時間、降低了費用，具有重要的研究意義和應用價值[15]。本實驗檢測的單一致病菌的靈敏度均達到101CFU/mL，而同時檢測4種致病菌的靈敏度時金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的靈敏度是102CFU/mL，志賀氏菌和單核增生李斯特菌的靈敏度是101CFU/mL。說明多種因素對多重PCR的靈敏度有影響，包括引物的相互影響、引物退火溫度等。對于細菌量較少的檢測標本，要經過增菌，避免多重PCR出現假陰性結果。

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Establishment of A Rapid Detection Method for Bacterial Pathogens in Meat by Polymerase Chain Reaction

LIU Hong-yu1，LI Yan1，CUI Hong-bin2
(1. College of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. College of Public Health, Harbin Medical University, Harbin 150086, China)

Objective: To establish a multiplex PCR for simultaneously detectingStaphylococcus aureus,Shigellaspp.,Salmonellaspp. andListeria monocytogenesin meat. Methods: The primers were designed according toStaphylococcus aureus nucgene,Shigellaspp.ipaHgene,Salmonellaspp.invAgene andListeria monocytogenesinlAgene. The target genes were amplified by multiplex PCR under optimized reaction conditions. Results: Four bacterial pathogens could be amplified, which revealed the special bands at the corresponding locations. When the meat samples were contaminated with four pathogens, the detection limits ofStaphylococcus aureusandSalmonellaspp. were 102CFU/mL, and the detection limits ofShigellaspp. andListeria monocytogeneswere 101CFU/mL. Conclusion: The established multiplex PCR method is more specific, rapid, and sensitive than traditional detection methods, which is suitable for the rapid detection of Staphylococcus aureus,Shigellaspp.,Salmonellaspp.andListeria monocytogenesin meat.

multiplex polymerase chain reaction (PCR)；pathogen；meat；detection

TS201.6

A

1002-6630(2011)06-0213-04

2010-04-12

黑龍江省科技廳資助項目(GA07B401)

劉紅玉(1970—)，女，副教授，博士，主要從事食品科學研究。E-mail：liuhongyu70@sohu.com