高效液相色譜法快速測定大米中的4種煙堿農藥殘留量

乙小娟，朱加葉，丁 萍，夏擁軍

(張家港出入境檢驗檢疫局，江蘇 張家港 215600)

高效液相色譜法快速測定大米中的4種煙堿農藥殘留量

乙小娟，朱加葉，丁 萍，夏擁軍

(張家港出入境檢驗檢疫局，江蘇 張家港 215600)

建立使用高通量(RRHT)色譜柱的高效液相色譜法同時測定大米中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清四種煙堿農藥殘留量的方法。樣品用乙腈提取，采用ENVI-Florisil和Carb復合固相萃取柱萃取凈化，液相色譜高通量RRHT色譜柱，258nm紫外測定，外標法定量。檢測過程快速準確，2.5min時4種農藥可完全分離。樣品中加標回收率為75.5%～96.0%，相對標準偏差為0.49%～4.36%，最低檢出限達到0.004mg/kg。峰面積與標準溶液質量濃度在0.1～1.0mg/L范圍內呈良好的線性關系，線性回歸系數大于0.9996。

呋蟲胺；噻蟲胺；吡蟲啉；吡蟲清；液相色譜；高通量色譜柱；固相萃取；大米

煙堿類殺蟲劑的作用機制主要是通過選擇性控制昆蟲神經系統煙堿型乙酰膽堿酯酶受體，阻斷昆蟲中樞神經系統的正常傳導，從而導致害蟲出現麻痹進而死亡[1]。可有效防治同翅目、鞘翅目、雙翅目和鱗翅目等害蟲，對用傳統殺蟲劑防治產生抗藥性的害蟲也有良好的活性。

從20世紀80年代中期由德國拜耳公司成功開發出第一個煙堿類殺蟲劑一吡蟲啉問世到目前為止，已有十幾個產品商品化或即將商品化[1]。如呋蟲胺(dinotefuran)、噻蟲胺(clothianidin)、吡蟲啉(imidacloprid)、啶蟲脒(acetamiprid，又名吡蟲清)等[2-4]，日本已規定大米中這4種煙堿類農藥最高殘留限量(MRL)為0.01～2mg/kg[5]，澳大利亞對谷物中吡蟲啉的最高殘留限量是0.05mg/kg[6]。

目前有文獻報道用HPLC-MS/MS檢測食品中的呋蟲胺[7]。文獻[8-10]報道用高效液相色譜法測定(HPLC)測定茶葉、蔬菜、水果中吡蟲啉的殘留。文獻[11-15]檢測蔬菜、茶葉和水果中吡蟲啉或啶蟲脒，文獻[16]報道了茶葉中6種煙堿農藥的HPLC-MS/MS檢測。目前尚未見使用高通量色譜柱的液相色譜方法同時檢測大米中4種煙堿類殺蟲劑殘留的報道。本實驗對大米中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的高效液相色譜測定方法進行研究，考察不同質量濃度的呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清在Florisil-Carb復合固相萃取柱上的保留行為。本方法采用乙腈提取，復合固相萃取柱凈化，HPLC-DAD分離檢測，外標法定量，旨在建立采用快速分離高通量色譜柱(rapid resolution high throughput，RRHT)同時測定大米樣品中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清殘留量的液相色譜方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

稻谷經清理、碾米、成品整理后的成品大米。

呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清標準品(純度≥97%)；乙腈(色譜純)；正己烷(農殘級)；丙酮(紫外光譜純)；氯化鈉(分析純)，140℃烘烤4h，置于干燥器內備用。

HP1200高效液相色譜儀(附DAD檢測器) 美國安捷倫公司；R200旋轉蒸發器 瑞士公司；KQ-500D超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；SPE小柱處理系統 美國Supelco公司；Superclean ENVI-Florisil(500mg/3mL)和Superclean ENVI-Carb(500mg/3mL)固相萃取柱；T25勻漿機 德國IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的提取

稱取25g粉碎試樣，置于250mL具塞錐形瓶中，加30mL水浸泡15min，準確加入乙腈50mL，振蕩提取30min后過濾，濾液收集到裝有5～7g氯化鈉的100mL具塞量筒中，收集濾液60～80mL，蓋上塞子，劇烈振蕩，靜置，使乙腈相和水相分層，從100mL具塞量筒中吸取25.00mL乙腈溶液，放入125mL心型瓶中，旋轉蒸發儀50℃以下濃縮至近干。用1mL丙酮溶解殘渣，待殘渣完全溶解后，加入9 m L正己烷，混勻，待凈化。

1.2.2 固相萃取凈化樣品

將Florisil和Carb固相萃取柱用連接頭上下串聯起來(Carb固相萃取柱在上)，5mL正己烷預淋洗，將1.2.1節制備的溶液移入Florisil和Carb的復合柱中，棄去流出液。然后用10mL丙酮-正己烷(50:50)淋洗柱子，收集15mL淋洗液，旋轉蒸發儀50℃以下濃縮至近干，用乙腈-水(30:70)定容至1mL，經0.22μm濾器濾至樣品瓶內，待測。

1.2.3 標準溶液配制及標準曲線

準確稱取適量的呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清標準品，用乙腈配制成100mg/L標準儲備液，用乙腈-水(30:70)將儲備液稀釋成0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.0mg/L混合標準溶液系列。按選定色譜條件進樣，以混合標準溶液中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的質量濃度(X)和組分色譜峰面積(Y)作標準曲線，4種化合物在0.1～1.0mg/L范圍內線性關系良好，其線性方程和相關系數見表1。

表1 呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的線性方程和相關系數Table 1 Linear equations and correlation coefficients of four neonicotinoid residues

1.3 色譜條件

色譜柱：XDB C18(4.6mm×50mm，1.8μm) RRHT；色譜柱溫度：25℃；流動相：A為體積分數0.2%的甲酸溶液，B為乙腈。

梯度洗脫：流動相：0.2%甲酸溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序：0min時，5% B；0～1.5min，線性增加至35% B，保持到3.5min，再升至75%，4.5min結束，之后進行系統平衡，平衡時間2min；流速2mL/min；進樣量2μL；檢測波長258nm，采集時間0.01min。

2 結果與分析

2.1 樣品提取劑的選擇

煙堿類農藥屬于極性物質，易溶于甲醇、乙腈等[16]，本實驗以乙腈為提取劑對大米中的煙堿類農藥進行提取。結果表明，用乙腈提取樣品，不僅可以減少大米中油脂的提取量，而且煙堿類農藥的回收率也能滿足要求。為了更好地保證乙腈滲入大米體內，在大米中先加入適量的水浸潤大米樣品，使其細胞完全漲開，再加入乙腈振蕩，可提高提取效率。

2.2 固相萃取柱的選擇

Florisil屬于一種正相固相萃取柱，對極性較強的化合物吸附力較強，是從有機基體中去除或分離極性物質的理想之選，它可以有效地吸附樣品中的脂肪酸和葉黃素[17]。選用Florisil柱凈化，用體積比1:9的丙酮-正己烷溶解提取液殘渣，采用體積比1:1的正己烷-丙酮洗脫，洗脫液中仍有黃色色素存在；然后通過使用Florisil和Carb混合凈化柱凈化，色素被活性炭吸附，減少了色素的干擾。當收集洗脫液15mL時，通過實驗發現，洗脫液中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清4種煙堿農藥的回收率可達95%以上。但是直接用10mL體積比為1:9的丙酮-正己烷溶解提取液殘渣，再用弗羅里硅土和活性炭混合凈化柱凈化，四種農藥的回收率低，均小于60%；改用1mL丙酮溶解提取液殘渣，再加入9mL正己烷混勻凈化，回收率符合實驗要求。這可能是由于煙堿農藥的極性大，體積比為1:9的丙酮-正己烷不能完全溶解樣品提取液殘渣中呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的緣故。

2.3 液相色譜柱的選擇

快速分離高通量(RRHT)色譜柱是指柱內填料粒徑為1.8μm、長度只有50mm的液相色譜柱，這種色譜柱在保證分離度的情況下，可以大大提高分析時間，縮短檢測周期[18]。采用XDB C18(4.6mm×50mm，1.8 μ m) RRHT柱在2.5min時就達到了4種煙堿農藥的完全分離(圖1)，比使用常規(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱加快了十幾分鐘，大大提高了工作效率。

圖1 呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清標準溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of four neonicotinoid standards

2.4 檢測波長的選擇

對于紫外-可見檢測器，檢測時一般選擇對樣品有最大吸收的波長進行，以獲得最大的靈敏度和抗干擾能力，對4種標準樣品進行了光譜掃描，呋蟲胺在270nm處有最大吸收，噻蟲胺在260nm處有最大的吸收，吡蟲啉在270nm處有最大的吸收，吡蟲清在250nm處有最大的吸收，綜合考慮4種農藥同時檢測的靈敏度，實驗結果表明，當檢測波長設定為258nm時，相同質量濃度的呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清標準溶液能夠獲得相似的靈敏度，最終選擇258nm作為檢測波長。

2.5 流動相的優化

在等度反相分離時，通過對標準溶液的實驗表明，當乙腈-水體積比為35:65左右時，檢測的靈敏度達到最佳，但呋蟲胺峰型不是很好。當使用0.2%甲酸為流動相A，起始梯度為95% A＋5% B時，峰型改善，1.5min后梯度上升至35% B，在所使用的梯度條件下，可將所有色譜峰在2.5min左右達到基線分離。整個分析4.5min結束。

2.6 溶劑效應

使用純乙腈作定容溶劑時，由于樣品溶劑強度大于乙腈-水流動相，呋蟲胺的峰形有所拖尾(伸舌)，會引起譜峰展寬和變形而導致定量不準，而后面的3個峰不受影響，溶解樣品有機相比例遠遠大于起始流動相中有機相比例時，色譜峰(尤其是較早洗脫的色譜峰)會有展寬現象。本實驗在乙腈中加入一定量的水調節溶劑強度，峰形窄而對稱，峰形得到明顯改善。將乙腈-水(30:70)作為樣品溶劑進樣，進樣量大時呋蟲胺的峰明顯拖尾，通過實驗將樣品量定為2μL。

2.7 回收率及精密度實驗

按RSN=10計算，本方法呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉和吡蟲清的最低檢出限均為0.004mg/kg。

采用添加回收的方法，在空白大米樣品中，分別稱取3份不含呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的大米樣品，分別添加10μg/mL混合標準溶液0.025、0.05、0.10mL，每份樣品按樣品檢測方法重復檢測6次，測得呋蟲胺回收率在87.5%～94.0%之間，相對標準偏差在0.57%～2.48%之間；噻蟲胺回收率在79.0%～90.0%之間，相對標準偏差在0.49～3.80%之間；吡蟲啉回收率在75.5%～96.0%之間，相對標準偏差在2.82%～3.91%之間；吡蟲清回收率在91.8%～94.5%之間，相對標準偏差在1.01%～4.36%之間。結果見表2。0.01mg/kg加標色譜圖見圖2。

表2 呋蟲胺、噻蟲胺、吡蟲啉、吡蟲清的回收率和精密度Table 2 Results of precision and recovery rate experiments

圖2 大米加標圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of spiked rice sample

3 結 論

運用液相色譜高通量柱同時測定了大米中4種煙堿農藥。所建立的方法簡便快速，2.5min內在色譜上即可達到4種農藥完全分離；準確度和精密度高，加標回收率在75.5%～96.0%，相對標準偏差在0.49%～4.36%；方法靈敏度高，最低檢出限達到0.004mg/kg。完全可滿足進出口大米中4種煙堿農藥的檢測要求。

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Determination of Neonicotinoid Residues in Rice by HPLC

YI Xiao-juan，ZHU Jia-ye，DING Ping，XIA Yong-jun
(Zhangjiagang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhangjiagang 215600, China)

A reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method has been developed for determining dinotefuran, clothianidin, imidacloprid and acetamiprid residues in rice. Neonicotinoid residues were extracted from the sample by acetonitrile, and then cleaned up with ENVI-Florisil and carb SPE tube. The HPLC detection was performed using a DAD detector in the external standard mode. Results indicated that average recovery rates in spiked samples were in the range of 75.5%－96.0%, the relative standard deviations varied between 0.49% and 4.36% and the detection limit was 0.004 mg/kg. A good linear correlation between peak areas and the concentrations of four neonicotinoid residues was observed in the range of 0.1－1000μg/mL with a calibration coefficient of 0.9996.

dinotefuran；clothianidin；imidacloprid；acetamiprid；high performance liquid chromatography；solid phase extraction；rice

O657.7

A

1002-6630(2011)06-0169-04

2010-05-04

江蘇省出入境檢驗檢疫局科研項目(2006KJ14)

乙小娟(1967—)，女，副主任技師，本科，主要從事進出口食品檢測研究。E-mail：yxj671001@yahoo.com.cn