高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)6種甜味劑

蔣曉彤，陳國(guó)松，姜玲玲，趙艷麗

(鞍山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，遼寧 鞍山 114006)

高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)6種甜味劑

蔣曉彤，陳國(guó)松，姜玲玲，趙艷麗

(鞍山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，遼寧 鞍山 114006)

建立同時(shí)測(cè)定6種人工合成甜味劑阿斯巴甜、糖精鈉、甜蜜素、安塞蜜、紐甜、甜聚糖甙的高效液相色譜分析方法。以Platicil ODS柱為分離柱，20mmol/L硫酸銨緩沖溶液(pH4.4)-乙腈為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)分離過程在30min內(nèi)完成。6種甜味劑在0.4～120mg/L范圍內(nèi)其質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.99967～0.99998，在4.0～10.0mg/kg范圍內(nèi)，樣品加標(biāo)回收率為85%～107%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.2%。該方法簡(jiǎn)便、快速，凈化效果較好，可用于食品中6種甜味劑的同時(shí)測(cè)定。

高效液相色譜(HPLC)；人工合成甜味劑；糖精鈉；甜蜜素；安塞蜜；阿斯巴甜；甜聚糖甙；紐甜

甜味劑是對(duì)能夠賦予食品甜味的物質(zhì)的總稱。由于糖精鈉(SA)、甜蜜素(SC)、安賽蜜(AK)、阿斯巴甜(ASP)、紐甜(NTM)、甜菊糖甙(S)等人工合成甜味劑具有高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，因此在食品中被廣泛應(yīng)用[1-3]。但其過量使用會(huì)造成一定的毒副作用。例如甜菊甙可能有一定致癌作用；阿斯巴甜可影響苯丙酮尿病患者的發(fā)育[4-5]；長(zhǎng)期食用糖精鈉會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不良，其致癌可能性尚未完全排除[6-7]；甜蜜素可能有致癌性，其代謝產(chǎn)物環(huán)己胺對(duì)心血管系統(tǒng)和睪丸有毒理作用[8-11]。近年來發(fā)現(xiàn)有些商家對(duì)人工合成甜味劑的泛濫使用以及一些食品標(biāo)簽中未注明使用人工合成甜味劑，有些則以“糖蜜素”、“甜味料”、“蛋白糖”等混淆視聽，以掩蓋其產(chǎn)品的危害性，對(duì)消費(fèi)者的身體健康構(gòu)成危害，嚴(yán)重侵犯了廣大消費(fèi)者的利益[12-15]。本實(shí)驗(yàn)旨在建立多種甜味劑的同時(shí)檢測(cè)法，以期為標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

糖精鈉 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；甜蜜素 美國(guó)Sigma公司；安塞蜜、阿斯巴甜、甜聚糖甙、紐甜 美國(guó)Supelco公司；乙腈(色譜純)；硫酸銨(優(yōu)級(jí)純)；其余試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水系統(tǒng)制備。

HP1100高效液相色譜儀(配有四元梯度泵、在線真空退氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器DAD) 美國(guó)安捷倫科技有限公司；AS3120A超聲波振蕩器 奧特塞恩斯儀器有限公司；pHS-3E型精密pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；Platicil ODS色譜柱；3K15離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；BP211D電子天平 北京Sartorius公司；ProElut PXC固相萃取柱。

1.2 色譜條件

色譜柱：ODS-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為20mmol/L硫酸銨(用H3PO4調(diào)pH4.4)-乙腈；梯度洗脫程序：乙腈：0～2min，5%；2～30min，5%～50%；流速0.8mL/min；柱溫為30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為200、226nm；進(jìn)樣量為20μL。

1.3 樣品前處理

所有樣品均為市場(chǎng)采集的樣品，按照品種將其分為飲料、蜜餞、醬腌菜、酒類等，其中飲料按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步分為碳酸飲料、果汁、茶飲料、含乳飲料、植物蛋白飲料和固體飲料。

1.3.1 介質(zhì)簡(jiǎn)單的樣品

例如碳酸飲料、果酒、葡萄酒等，稱取10g樣品(精確至0.001g)，置于25mL容量瓶中，用水定容(如有乙醇需水浴加熱除去乙醇后再用水定容至原體積)至刻度，混勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液待上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 介質(zhì)復(fù)雜的樣品

例如茶飲料、果汁等，稱取6g樣品(精確至0.001g)，置于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，4000r/min離心10min，取上清液，待測(cè)。

1.3.3 介質(zhì)為固體的樣品

例如蜜餞、醬腌菜等，將樣品粉碎，稱取2g樣品(精確至0.001g)，稱取適量置于25mL，加水后并超聲振蕩20min，加水定容至25mL。4000r/min離心10min，取上清液，待測(cè)。

1.3.4 含乳飲料和植物蛋白飲料

稱取6g樣品(精確至0.001g)，置于25mL容量瓶中，依次加入2mL 0.08mol/L K4[Fe(CN)6](pH4.4)和2mL 0.25mol/L乙酸鋅(pH4.5)溶液，劇烈振蕩2min，以沉淀蛋白質(zhì)，加水定容至刻度，4000r/min離心10min，取上清液，4000r/min離心10min，取上清液，待測(cè)。

1.4 試樣的凈化

取1.3.2～1.3.4節(jié)上清液3mL經(jīng)固相萃取柱(事先經(jīng)3mL乙腈活化，再用3mL水平衡)萃取。然后依次用3mL 20mmol/L硫酸銨和3mL乙腈洗脫，收集洗脫 液于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液待上機(jī)測(cè)定。

1.5 測(cè)定

取處理液與混合標(biāo)準(zhǔn)使用液各20μL注入高效液相色譜分析儀進(jìn)行分離，以保留時(shí)間定性，峰面積進(jìn)行外標(biāo)法定量。1.6 計(jì)算公式

樣品中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、甜菊糖甙、紐甜含量(X)，單位用(mg/kg)或(mg/L)表示，按式(1)計(jì)算。其中糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、甜菊糖甙、紐甜按200nm波長(zhǎng)的峰面積計(jì)算；安賽蜜按226nm波長(zhǎng)的峰面積計(jì)算。

式中：X為樣品中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、甜菊糖甙、紐甜含量/(mg/kg)或/(mg/L)；A2為樣品峰面積；A1為標(biāo)液峰面積；K為稀釋倍數(shù)；C為標(biāo)液質(zhì)量濃度/(μg/mL)；m為樣品質(zhì)量/g；V為樣品洗脫液濃縮定容體積/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器，在190～400nm范圍內(nèi)對(duì)所有分析物進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種甜味劑的最大吸收波長(zhǎng)分別為：糖精鈉2 04 nm、甜蜜素194nm、安塞蜜226nm、阿斯巴甜202nm、甜聚糖甙200nm、紐甜206nm。選擇200nm波長(zhǎng)對(duì)糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、甜聚糖甙、紐甜進(jìn)行測(cè)定，選擇226nm波長(zhǎng)對(duì)安塞蜜進(jìn)行測(cè)定。

2.2 流動(dòng)相的選擇

因?yàn)榧状嫉慕刂共ㄩL(zhǎng)為210nm左右，乙腈的截止波長(zhǎng)為190nm左右，而糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、甜聚糖甙、紐甜選擇在200nm處檢測(cè)。且乙腈的溶劑強(qiáng)度較高，黏度較小，故測(cè)定時(shí)選用乙腈。

實(shí)驗(yàn)考察乙酸胺、硫酸銨、檸檬酸銨等溶液作為緩沖溶液是對(duì)分離度的影響，結(jié)果表明，乙腈-硫酸銨緩沖體系的洗脫效果最好。當(dāng)硫酸銨濃度分別為10、20、40mmol/L時(shí)，20、40mmol/L分離效果較好，且二者相差不大，考慮到緩沖鹽濃度增大，對(duì)色譜柱及系統(tǒng)管路造成的損害也會(huì)加大，所以選擇20mmol/L硫酸銨最為緩沖鹽溶液。調(diào)節(jié)20mmol/L硫酸銨緩沖液的pH值分別為3.0、4.0、4.4、5.0、6.0，在pH4.4條件下，6種甜味劑的色譜峰形和分離度良好。

流動(dòng)相配比對(duì)分離效果的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨緩沖液pH4.4，乙腈體積分?jǐn)?shù)小于8%時(shí)，幾種甜味劑均可實(shí)現(xiàn)基線分離，但阿斯巴甜和紐甜的保留時(shí)間比較長(zhǎng)，峰形拖尾。隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增大，所有分析物的保留時(shí)間均逐漸縮短。乙腈的體積分?jǐn)?shù)大于17%時(shí)，安塞蜜、糖精鈉和甜蜜素的色譜峰重疊，紐甜的保留時(shí)間大于40min。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間、提高分離度、改善峰形。考慮到本實(shí)驗(yàn)在短波長(zhǎng)處測(cè)定，梯度增加太快會(huì)嚴(yán)重漂移，增加太慢分析時(shí)間就會(huì)加長(zhǎng)，最終選擇的梯度洗脫程序?yàn)橐译妫?～2min，5%；2～30min，5%～50%；流速0.8mL/min。在此色譜條件下，6種甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見圖1。

表3 實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率結(jié)果Table 3 Recovery rates for 6 sweeteners

圖1 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed sweetener standards

2.3 線性范圍、精密度和檢出限

表1 線性關(guān)系與檢出限Table 1 Linear relationship and detection limit of this method

在確定的最佳色譜分離條件下對(duì)一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜測(cè)定，以各組分的峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C/(mg/L))繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限(RSN=3)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。結(jié)果表明，所有分析物在0.4～120mg/L范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，可以滿足定量分析的需要。

2.4 實(shí)際樣品中甜味劑含量及加標(biāo)回收率的測(cè)定

表2 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 2 Determination results for real samples

在表2中測(cè)定結(jié)果基礎(chǔ)上，在線性范圍內(nèi)加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。每種樣品平行測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果見表3。平均加標(biāo)回收率在85%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.2%，測(cè)定結(jié)果令人滿意。

3 結(jié) 論

通過對(duì)多種甜味劑高效液相色譜法的實(shí)驗(yàn)分析，6種甜味劑在4.0～10.0mg/kg范圍內(nèi)，樣品加標(biāo)回收率為85%～107%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.2%。該方法簡(jiǎn)便、快速，凈化效果較好，可用于食品中多種甜味劑的檢測(cè)方法，以消除對(duì)商品中單一甜味劑檢測(cè)而造成其他甜味劑漏檢的可能性。

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Simultaneous HPLC Determination of 6 Sweeteners

JIANG Xiao-tong，CHEN Guo-song，JIANG Ling-ling，ZHAO Yan-li
(Anshan Institute of Products Quality Supervision and Inspection, Anshan 114006, China)

A reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method was established to simultaneously determine six artificial sweeteners including aspartame (ASP), sodium saccharin (SA), sodium cyclamate (SC), acesulfame potassium (AK), neotame (NTM) and stevioside. The separation was carried out on a Platicil ODS (250 mm × 4.6 mm, 5μm)column through gradient elution using 20 mmol/L (NH4)2SO4-acetonitrile (pH 4.4) as mobile phase. The whole separation process was completed in 30 min before diode array detection. An excellent linear relationship between peak area and sweetener concentration in the range of 0.4－120 mg/L with a correlation coefficient varying from 0.99967 to 0.99998 was observed. The recovery rates of spiked samples in the range of 4.0－10.0 mg/kg ranged from 85% to 107% with a relative standard deviation less than 3.2%. Therefore, this method is characteristics of simple operation, rapid detection and excellent purification efficiency so that it can be used for the routine analysis of these sweet additives in foods and beverages.

HPLC；artificial sweeteners；sodium saccharin (SA)；sodium cyclamate (SC)；acesulfame potassium(AK)；aspartame (ASP)；stevioside (S)；neotame (NTM)

TS207.3

A

1002-6630(2011)06-0165-04

2010-03-28

國(guó)家質(zhì)檢總局質(zhì)檢公益性科研項(xiàng)目(200810923)

蔣曉彤(1967—)，女，高級(jí)工程師，學(xué)士，主要從事食品檢測(cè)研究。E-mail：lnaszjs@sohu.com