序貫設計優化佛手瓜汁生產細菌纖維素工藝

李家洲，肖玉平，黃榮林，趙 鑫

(廣東輕工職業技術學院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300)

序貫設計優化佛手瓜汁生產細菌纖維素工藝

李家洲，肖玉平，黃榮林，趙 鑫

(廣東輕工職業技術學院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300)

在以佛手瓜汁為原料利用木醋桿菌(Acetobacter xylinus)發酵生產細菌纖維素的過程中，利用Plackett-Burman分部析因試驗設計確定出蔗糖質量濃度和pH值對產量具有顯著影響，再利用最速爬坡試驗確定出這兩個因素的中心點，最后以中心點進行中心組合試驗設計，建立試驗空間下的模型，優化出最佳的因素水平為溫度28℃、(NH4)2SO4質量濃度0.3g/100mL、佛手瓜汁用量(體積分數)100%、蔗糖質量濃度6.54g/100mL、pH4.19。在最優條件下可得最大干基產量為4.18g/L。

佛手瓜汁；細菌纖維素；序貫設計

佛手瓜(Chayotes，Sechium edule)，葫蘆科佛手瓜屬栽培種，又名隼人瓜、菜肴梨、合掌瓜、拳頭瓜等，多年生攀緣性草本植物。原產墨西哥和中美洲，18世紀傳入歐洲，后傳入東南亞，20世紀初自緬甸傳入我國南方地區，在我國江南地區種植，尤以廣東、廣西、福建、浙江、云南等省最為廣泛，并逐漸傳入我國北方作一年生蔬菜栽培。果實有綠皮與白皮兩種品系，果肉白色，梨形，有5條縱溝，質量200～300g。佛手瓜性喜溫暖、肥沃、濕潤與保水土壤，不耐澇，能耐高溫。佛手瓜生產旺盛，果實產量極高。單株覆蓋面積達60～80m2，每株年產果300～500個，畝產可達3000～4000kg。佛手瓜生長迅速、產量高、營養豐富，但由于其口感一般，故其價格一直較低，限制了佛手瓜的推廣。對佛手瓜進行深加工，延長產業鏈，增加附加值，是必由之途。近年來，針對佛手瓜深加工研究不斷。佛手瓜可開發成酸奶[1]、膳食纖維素[2]、果脯[3]、蔬菜酒[4]、果醬[5]及腌制品[6]等。

1866年，英國科學家Brown首次報道木醋桿菌可合成細菌纖維素(bacterial cellulose，BC)[7]。后經研究證實，除了醋酸桿菌屬外，能產細菌纖維素的菌種還包括根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬等[8]。細菌纖維素是葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接成的高分子聚合物[9]。細菌纖維素具有許多植物纖維素無可比擬的優點，故具有廣泛的用途。例如，食品行業中用作加工椰果的原料[10]、造紙行業用于生產特種功能紙[11]、環保行業用作重金屬吸附材料[12-13]、生物醫學材料[14-15]、酶與細胞支撐材料[16]、化妝品中的保水材料等。目前，細菌纖維素的生產主要以椰子汁為原料。眾所周知，椰子由于受種植區域的局限，其來源十分有限，原料成本相對較高。利用佛手瓜汁富含營養成分的特點，用作工業發酵培養基生產高附加值的細菌纖維素，既是另一種佛手瓜深加工研究方向，也可拓寬細菌纖維素生產的原料渠道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠皮佛手瓜，購自廣州市菜市場。

木醋桿菌(Acetobacter xylinus)，本實驗室保存。

酵母膏、細菌學蛋白胨 廣東環凱微生物科技有限公司；葡萄糖、KH2PO4、檸檬酸、NaCl、蔗糖、硫酸銨(均為分析純) 廣州化學試劑廠。

1.2 培養基

佛手瓜汁制備：新鮮佛手瓜用榨汁機粉碎，煮沸破壞葉綠素，然后過濾去除濾渣，收集濾液備用。種子培養基：葡萄糖2g/100mL、酵母膏0.5g/100mL、蛋白胨0.5g/100mL、KH2PO40.1g/100mL、檸檬酸0.1g/100mL、自然pH值、110℃滅菌30min；用作斜面時加瓊脂2g/100mL。發酵培養基：新鮮制備的佛手瓜汁1L、蔗糖4g/100mL、硫酸銨0.3g/100mL、KH2PO40.1g/100mL、NaCl 0.2g/100mL、pH4.0～5.0，分裝組織培養瓶，每個100mL，121℃滅菌15min。

1.3 方法

1.3.1 種子培養

將經斜面活化的木醋桿菌接種于液體種子培養基150r/min振蕩培養，于30℃培養16h。

1.3.2 發酵培養條件

在我國經濟發展過程中，土地發揮著巨大作用，工業發展或第三產業發展都離不開土地，對于很多農民來說，土地使用權被交易意味著維持基本生存的方式喪失，在加重他們基本生活困境的同時，造成他們對國家的信任大幅度降低。基于這種情況，國家開始對占用土地的農民進行經濟補償。隨著國家對農民土地征收并給予經濟補償的現象增多，商家在發展經濟的同時也著眼于對農民土地的使用上，這種現象在經濟誘導下日趨嚴重，大量農民因此獲得一時的經濟來源，隨著時間的推移，造成長久生存發展上的危機。針對此問題，國家應加強控制，通過政策以及具體管理措施來改善。

接種量為體積分數10%，30℃靜置培養8d，收集纖維素膜分析。

1.3.3 試驗設計和統計分析

采用序貫試驗設計原理，將溫度、蔗糖質量濃度、佛手瓜汁用量、pH值、硫酸銨質量濃度、KH2PO4質量濃度6個參數進行分部析因設計，篩選對細菌纖維素有顯著影響的因素并初步考察各因素間的相互關系。利用爬坡設計尋找合適的試驗空間。最后再利用中心組合設計來確定在試驗空間內的最大或最小響應點(即相應因素的最佳取值)。試驗設計與數據分析主要應用Minitab 15設計與SAS 9.1統計分析軟件[17]。

1.3.4 纖維素干質量測定

收集纖維素，置于80℃ 0.1mol/L NaOH溶液中維持2h，冷卻后用0.1mol/L HCl中和，自來水充分洗滌，80℃干燥至質量恒定，稱量。

2 結果與分析

2.1 分部析因設計

圍繞提高以佛瓜汁為主要培養基的纖維素發酵水平，選定溫度、蔗糖質量濃度、佛手瓜汁用量、p H值、硫酸銨質量濃度、KH2PO4質量濃度6個參數進行序貫試驗設計，各參數的水平選擇見表1。

表1 分部析因設計的因素與水平Table 1 Factors and levels in fractional factorial design (FFD)

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 2 Protocol and results of Plackett-Burman design

回歸分析結果見表3。

表3 Plackett-Burman試驗結果的回歸分析Table 3 Regression analysis of Plackett-Burman design experimental results

Plackett-Burman試驗結果的回歸因子主效應圖見圖1。

由表3和圖1可知，在6個因素中，X2(蔗糖質量濃度)與X5(pH值)對細菌纖維素的產量影響最大(P＜0.05)。對表2的結果進行曲率分析，顯示以上設計的試驗空間為一曲面，但有P=0.081＞0.05，說明在該曲面內不存在極值響應點，需繼續搜索。圖1表明，在設定的空間內溫度對纖維素的產量幾乎無影響；(NH4)2SO4和KH2PO4影響呈弱的負相關；佛手瓜汁用量呈弱的正相關。根據以上試驗結果，在后續優化試驗過程確定溫度28℃、(NH4)2SO4質量濃度0.3g/100mL、佛手瓜汁用量100%。

圖1 Plackett-Burman試驗結果的回歸因子主效應圖Fig.1 Main effects plot of each regression factor in Plackett-Burman design

2.2 最速爬坡試驗

表4 最速爬坡試驗設計與結果Table 4 Protocol and results of steepest ascent design

由于細菌纖維素的產量與蔗糖質量濃度呈現正相關，故確定3g/100mL為原點；pH值與產量呈現負相關的關系，故確定pH6.0為原點，進行最速爬坡試驗設計，結果見表4。

由表4可以看出，試驗10#(X2=6.6，X5=4.2)得到細菌纖維素的最大產量4.81g/L。該點前，自試驗1#～9#，產量逐漸上升；該點之后，自試驗11#～12#產量逐漸下降。故選擇(X2=6.6，X5=4.2)作為中心點進行中心組合試驗。

2.3 中心組合試驗設計

根據分部析因試驗結果，蔗糖質量濃度與pH值是影響細菌纖維素的顯著性因素，故選擇這兩個因素進行中心組合試驗設計，以尋找最優工藝條件。根據最速爬坡試驗結果，(X2=6.6，X5=4.2)得到的產量最高，故選擇此點為中心。考慮參數變化幅度對產量影響的顯著性程度，蔗糖應選擇較大的空間，pH值可選擇相對較小的空間。綜合分部析因與最速爬坡試驗結果，選擇X2(6.0，7.2)、X5(4.0，4.4)為空間，進行中心組合試驗設計。試驗設計及結果見表5。

表5 中心組合設計及結果Table 5 Protocol and results of central composite design

響應曲面分析表明，曲率P=0.001＜0.05，因此，在試驗空間內有極值響應點，其曲面圖見圖2。

圖2 中心組合試驗蔗糖質量濃度與pH值對細菌纖維素產量的影響Fig.2 Response surface plot indicating the effects of sugar concentration and pH on bacterial cellulose production

對圖2的曲面進行回歸分析得到回歸模型為：

Y=1.96155X2＋13.7502X5－0.156597X22－1.65937X52＋0.0208333X2X5－30.3677

該回歸模型具有非常高的顯著性，其P=0.001＜0.01、R2=93.44%、R2Adj=88.75%，說明該模型能擬合本試驗空間中93%的試驗結果。對圖2中的響應曲面進行響應優化分析，可得到Y最大=4.8149g/L，其對應的因素值分別為蔗糖質量濃度(X2)為6.5400g/100mL、pH(X5)4.1857，在此條件下進行多次重復實驗，均接近模型值，這證實了該模型的可靠性。

3 結論與討論

利用序貫試驗設計對木醋桿菌利用佛手瓜汁發酵生產細菌纖維素的工藝條件進行探討。確定了較合適的發酵工藝條件：溫度28℃、(NH4)2SO4質量濃度0.3g/100mL、佛手瓜汁用量100%、蔗糖質量濃度6.54g/100mL、pH4.19。在優化的試驗條件下，木醋桿菌以佛手瓜汁為原料發酵生產細菌纖維素干基產量最高可達4.81g/L。結果表明，統計分析方法在優化及建立穩定的發酵工藝條件等方面是一個很好的工具，具有十分重要的作用。對受多個因素影響的發酵工藝，先利用Plackett-Burman分部析因試驗設計，對各個影響因子對發酵的影響程度進行評估，找出影響顯著的因子，然后利用最速爬坡試驗找到顯著影響因子的中心點，以此進行中心組合試驗，進行曲面分析與回歸，可建立工藝模型，找到試驗空間中的極大值點，為建立最佳工藝條件提供依據和指導。

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Sequential Design Optimization of Bacterial Cellulose Production byAcetobacter xylinusUsing Chayote(Sechium edule) Juice as the Basal Fermentation Medium

LI Jia-zhou，XIAO Yu-ping，HUANG Rong-lin，ZHAO Xin
(Department of Food and Bioengineering, Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300, China)

Chayote (Sechium edule) Juice was used as the basal fermentation medium to prepare bacterial cellulose through the fermentation ofAcetobacter xylinus. Plackett-Burman factorial design was used to determine the effects of sugar concentration and pH on productivity of bacterial cellulose. Steepest ascent method was used to determine the central point of both factors. Central composite design was used to build the experimental model and the optimal processing conditions were fermentation temperature of 28 ℃, (NH4)2SO4 concentration of 0.3 g/100 mL,Schehium edulejuice concentration of 100 %, sugar concentration of 6.54 g/100 mL and pH 4.19. Under the optimal processing conditions, the yield of bacterial cellulose was up to 4.18 g/L (dry weight).

Schehium edulejuice；bacterial cellulose；sequential design

TS255.36

A

1002-6630(2011)06-0095-04

2010-06-04

廣東省農業攻關項目(2005B20401011)

李家洲(1976—)，男，副教授，博士研究生，研究方向為微生物發酵工藝。E-mail：lijiaou@gdqy.edu.cn