分批發酵和補料分批發酵結合生產透明質酸的研究

鄧開野，譚梅唇

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225；2.廣西大學，廣西南寧530004）

分批發酵和補料分批發酵結合生產透明質酸的研究

鄧開野1，譚梅唇2

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州510225；2.廣西大學，廣西南寧530004）

采用單一補料分批培養方式進行補料發酵時，對發酵過程中菌體生長，產物合成以及副產物的影響進行研究。結果表明：該方法可以通過改善發酵過程中環境條件，來提高透明質酸（HA）的產量。和分批發酵相比，發酵液中HA的量提高大約3.5%。HA發酵可以采用單一補料分批發酵的方法來提高生產強度，縮短發酵周期，有效地降低生產成本，是一種可以有效提高HA發酵生產性能指標的現代發酵技術。

分批發酵，補料分批發酵，透明質酸

補料分批培養兼有分批培養和連續培養的優點，并在某種程度上克服了它們所存在的缺點。和分批培養方式相比，此方法可以解除培養過程中的底物抑制、產物的反饋抑制和葡萄糖的分解阻遏效應；對于耗氧過程，可以避免在分批培養過程中因一次性投糖過多造成的細胞大量生長、耗氧過多以致通風攪拌設備不能匹配的狀況；在某種程度上可以減少微生物細胞的生成量、提高目的產物的轉化率；微生物細胞可以被控制在一系列連續的過渡態階段，可用來控制細胞的質量；并可重復某個時期細胞培養的過渡態，可用于理論研究。和連續培養方式比較，此方法不需要嚴格的無菌條件；不會產生微生物菌中的老化和變異；最終產物濃度較高，有利于產物的分離，使用范圍廣［1－2］。本研究對分批培養和單一補料分批培養方式進行了比較研究，考察了葡萄糖的變化狀況，以及分別采用兩種方式生產HA過程中，菌體的生長、HA的合成和發酵副產物乳酸的變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種 實驗室篩選和誘變出的產生透明質酸的變異株；種子培養基 2%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏 1%，NaNO30.4%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，調pH7.0，121℃滅菌20min；發酵培養基 4%淀粉葡萄糖水解液，蛋白胨1%，酵母膏1%，硝酸鈉0.5%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，調pH7.0，121℃滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 斜面與種子培養方法 將篩分的菌種于斜面培養基上劃線傳代。將斜面試管放在恒溫箱中，在37℃條件下培養14～16h。培養結束后，用接種針在斜面培養基中挑取生長狀態良好的菌落2～3環，接入250mL三角燒瓶中，燒瓶內裝50mL種子培養基，把接菌后密封好的250mL三角燒瓶置于以200r/min旋轉的搖床中培養16h，培養溫度37℃。

1.2.2 搖瓶培養方法 培養結束后，按10%的接種量計算，從250mL三角燒瓶中吸取0.2mL已培養好的菌液，接入500mL三角燒瓶，內裝發酵培養基20mL。再將此500mL三角瓶置于轉速為200r/min的搖床中振蕩培養，在37℃條件下培養24h。

1.2.3 分批培養和補料分批培養比較

1.2.3.1 分批培養 于10L的發酵罐（江蘇達森）中加入6L發酵培養基，121℃下滅菌30min，初始攪拌轉速 100r/min，不斷地提高轉速，直到轉速達到200r/min。接種后開始主發酵直至發酵結束，從發酵液中提取HA。分批發酵淀粉水解液的初始葡萄糖濃度為5%。

1.2.3.2 補料分批培養 在10L的發酵罐中加入4L的發酵培養基，121℃下滅菌30min，初始攪拌轉速100r/min，不斷地提高轉速，直到轉速達到200r/min。初始葡萄糖濃度為3%，每隔一段時間，取樣分析發酵液中的葡萄糖含量，待發酵體系中葡萄糖濃度1%時，便補加葡萄糖濃度為5%的新鮮培養基，控制發酵體系中的葡萄糖濃度為2%，直至發酵液的總體積為6L為止，便停止補料。

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 吸光度（OD值）的測定 發酵液50mL在4000r/min條件下離心15min后，在上清液中加入3倍體積的乙醇，析出的沉淀加入與發酵液同體積的0.1mol/L NaCl溶液，置于磁力攪拌器，在196nm處測定發酵液的吸光度，該吸光度值的大小可以指示發酵液中透明質酸含量的高低。

1.2.4.2 菌體含量的測定 采用干重法。將發酵液離心后取沉淀，加稀酸溶解碳酸鈣，再離心取沉淀，80℃干燥24h后，稱取重量，計算細胞濃度。

1.2.4.3 乳酸含量測定 對羥基聯苯法［3］。

1.2.4.4 其他指標的測定 透明質酸含量測定：采用Bitter－Muir氏法［4］；比旋光度的測定：稱取5mg HA，用蒸餾水溶解后，裝入10cm比旋管，在比旋儀上測定；葡萄糖含量測定：3，5－二硝基水楊酸法［5］。

2 結果與分析

2.1 紫外吸收光譜

將sigma公司的HA標準品和發酵液的提取物均分別配制成500!g/mL的水溶液，使用紫外分光光度計在190～300nm波長范圍內進行掃描。兩者均在波長196nm處出現多糖特征峰。標準樣品HA和發酵液提取物的紫外掃描結果分別如圖1和圖2所示。

圖1 HA標準品的紫外圖譜

圖2 發酵液提取物的紫外圖譜

從圖中可以看出，發酵液提取物的粗品HA的紫外光譜在196nm處有特征吸收峰，同sigma公司的HA標準品的特征吸收峰相同，表明利用其最大波長處紫外光譜分析可以作為衡量發酵液中HA含量多少的依據。

2.2 分批培養和補料分批培養的葡萄糖濃度的變化

圖3為分批發酵過程和補料分批發酵過程中葡萄糖濃度的變化曲線。由圖可知，在分批發酵過程中，葡萄糖的初始濃度值較高，為5%，由于在整個過程中沒有再補充，所以一直呈下降的趨勢，待菌體的對數生長期和穩定期時，底物中葡萄糖的含量不是很高，對產物的積累有一定的抑制作用，而且由于初期的高葡萄糖濃度，容易造成中間產物的積累，如乳酸等，又會對產物也形成抑制作用。

圖3 分批培養和補料分批培養的葡萄糖消耗曲線

而補料分批培養則克服了上述的缺點，初始的葡萄糖濃度為3%，當底物的葡萄糖濃度降低到1%左右時，開始補加新鮮的培養基。這樣度過了滯后期的菌體在對數生長期和穩定期中，可以處于比較穩定的環境中進行生長和產物的積累，對獲得高得率產物有促進作用。

2.3 分批培養和補料分批培養方式對菌體生長的影響

圖4 分批培養和補料分批培養對菌體生長的影響

由圖4可知，在主發酵前期，兩種培養方式對菌體生長的影響并沒有太大的差別。分批培養過程中，菌體量呈穩定的上升趨勢，在12～16h范圍內為對數生長期，因此菌體量增加速度較快，而穩定期則是在16～22h，然后開始呈下降趨勢。而從補料分批培養的菌體生長曲線可以明顯地看出，菌體在6h左右就開始迅速增長，經過對數生長期之后，由于補充了新鮮的培養基，此時發酵液中的養分比較完全，所以，在14～26h范圍內，菌體處于穩定期內，此培養方式可以令菌體的穩定期維持較長時間，這是任何一種工業發酵所期望的，因為長的穩定期可以促使產物的積累，延長產物積累時間，就意味著產率的提高。

2.4 分批培養和補料分批培養方式對HA合成的影響

由圖5可以看出，采用補料分批培養的方式，在發酵液中HA的積累速度要快于分批培養中產物的積累，并且從產物積累開始，HA的量就高于分批培養發酵液中HA的含量，這和圖3和圖4所獲得的結果相偶聯。

圖5 分批培養和補料分批培養對HA合成的影響

2.5 分批培養和補料分批培養方式對乳酸合成的影響

鏈球菌的生長都伴隨著乳酸的形成，乳酸和乙酸是其中最主要的兩種。不過乙酸的形成量很少，只是乳酸的10%，所以本研究忽略了乙酸，對此不做分析。圖6為分批培養和補料分批培養過程中乳酸的變化曲線。然而，乳酸的大量形成，對HA的合成會產生抑制。

圖6 分批培養和補料分批培養對乳酸合成的影響

由圖6可以看出，對于分批發酵，從6h開始到16h左右，發酵液中乳酸的增加比較迅速，而最大值可達到61.4g/L。而補料分批發酵過程中，乳酸的量則一直呈上升的趨勢，且含量比較高。這是由于和分批培養相比較，補料的操作使得培養液中的葡萄糖含量在發酵后期要高些，這是因為該菌株生長代謝所需要的能量主要依靠葡萄糖不完全代謝而生成乳酸和乙酸所提供，所以在整個補料分批培養過程中，乳酸的量一直在增加。

3 結論

3.1 本研究采用補料分批培養方式進行補料發酵時，通過對發酵過程中菌體生長，產物合成及副產物的影響來看，該方法可以通過改善發酵過程中環境條件，來提高HA的產量。和分批發酵相比，發酵液中HA的量提高大約3.5%。

3.2 HA發酵可以采用補料分批發酵的方法來提高生產強度，縮短發酵周期，有效地降低生產成本，是一種可有效提高HA發酵生產性能指標的現代發酵技術。

［1］郭學平，王春喜，崔大鵬.發酵法制備透明質酸［J］.日用化學工業，1994（2）：47.

［2］郭學平，王春喜，凌沛學，等.透明質酸及其發酵生產概述［J］.中目生化藥物雜志，1998，19（4）：209.

［3］Barker S B，Summerson W H.The Colorimetric determination of lactic acid in biological material［J］.J Biol Chem，1949，138：535－554.

［4］Bitter T，Ewins R.Modified carbazole reaction for uronic acid［J］.J Biol Chem，1961，81：43.

［5］Miller G L.Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Anal Chem，1960，31（3）：426－428.

Study on producing hyaluronic acid by compound of batch fermentation and batch－feeding fermentation

DENG Kai－ye1，TAN Mei－chun2
（1.College of Light Industry and Food Technology，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；2.Guangxi University，Nanning 530004，China）

The single batch－feeding fermentation was adopted.The biomass growth，product synthesis，effects of byproducts were studied during the course of fermentation.The results showed it could improve the HA yield through improving the environmental condition during the course of fermentation.Comparing with batch fermentation，HA yield could be increased 3.5%.HA fermentation can improve the production intensity，shorten fermentation period，decrease the cost by single batch feeding fermentation.

batch fermentation；batch－feeding fermentation；hyaluronic acid

TS201.1

A

1002－0306（2011）01－0166－03

2010－01－06

鄧開野（1968－），女，博士，副教授，研究方向：發酵工程。