三種維藥提取物對蛋白酪氨酸磷酸酶 1B抑制作用的研究

劉禾培,竇 君,馬 紀(jì),信學(xué)雷,趙海清,阿吉艾克拜爾·艾薩＊

1新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,烏魯木齊 830046;2中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所新疆植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830011

三種維藥提取物對蛋白酪氨酸磷酸酶 1B抑制作用的研究

劉禾培1,2,竇 君2,馬 紀(jì)1,信學(xué)雷2,趙海清2,阿吉艾克拜爾·艾薩2＊

1新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,烏魯木齊 830046;2中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所新疆植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830011

蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B)是胰島素增敏的新靶點(diǎn)之一。本文研究了芳香新塔花、沙生蠟菊、驅(qū)蟲斑鳩菊等 3種維藥石油醚提取物對 PTP1B活性的影響及其對酶的抑制類型。結(jié)果表明,所構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)能高表達(dá)重組 PTP1B(his-PTP1B1-321),分子量為 40.8 kDa。3種維藥提取物對 PTP1B均表現(xiàn)出不同程度的抑制活性,其 I C50值分別為 20.2μg/mL,12.65μg/mL和 9.7μg/mL。芳香新塔花提取物抑制作用類型為非競爭性,沙生蠟菊提取物是競爭性,驅(qū)蟲斑鳩菊提取物為混合性競爭抑制;抑制常數(shù) (Ki)分別為為 0.275μg/mL,1.245μg/mL,0.192μg/mL。本研究結(jié)果將為維藥的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

維藥;蛋白酪氨酸磷酸酯酶 1B;抑制作用;原核表達(dá)

Abstract:Protein tyrosine phosphatase-1B is one of new drug targets against insulin sensitizer.In this study,we investigated the inhibitory effect of petroleumether extracts from 3 Uygur herbs,includingZiziphora ClinopodioidesLam.,Helichrysum arenarium(Linn.)Moench,andVer-nohiaanthelmintica(L.)willd,on the PTP1B activity and the mode of inhibition.The results showed that recombinant PTP1B was highly expressed by the prokaryotic expression system and its molecularweigh was 40.8 kDa.Three extracts showed different inhibitory effects on the PTP1B activity,with I C50values of 20.2μg/mL,12.65μg/mL,and 9.7μg/mL,respectively.The enzyme kinetic studies revealed non-competitive type of inhibition,competitive type of inhibition,andmixed competitive type of inhibitionwith the inhibitory constants(Ki)of 0.275μg/mL,1.245μg/mL,and 0.192μg/mL,respectively.The studywillprovide support for further exploration and utilization ofUygur herbs.

Key words:Uygur herbs;PTP1B;inhibition;prokaryotic expression system

2型糖尿病以胰島素抵抗為主要特征。在治療2型糖尿病的潛在靶點(diǎn)中,蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)是一個(gè)極為重要的藥物靶點(diǎn)。PTP1B是胰島素信號通路中主要的負(fù)性調(diào)控因子[1,2],對 2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展有重要作用。多項(xiàng)研究[3,4]表明,PTP1B表達(dá)水平降低可使實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟和肌肉組織中胰島素受體和胰島素受體底物蛋白的磷酸化增強(qiáng),胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng),提高胰島素敏感性。因此,深入研究 PTP1B及其有效的抑制劑對于 2型糖尿病的治療具有良好的發(fā)展前景。

維吾爾醫(yī)藥具有 2500多年的歷史,是中國傳統(tǒng)醫(yī)藥和維吾爾優(yōu)秀傳統(tǒng)文化的重要組成部分,在治療心血管病、糖尿病等疑難雜癥方面有獨(dú)特的療效。因此從維藥中篩選高效低毒的 PTP1B抑制劑是非常有優(yōu)勢的。本文以芳香新塔花 (Ziziphora ClinopodioidesLam)、沙生蠟菊 (Helichrysumarenarium(Linn.)Moench)、驅(qū)蟲斑鳩菊 (Vernonia an the lminti-ca(L.)willd)等三種維藥為研究材料,以石油醚為提取溶劑,獲得具有抑制 PTP1B活性的組分,同時(shí)分析了這些提取物對酶的抑制類型。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

pNPP(對-硝基苯磷酸二鈉 )為 Sigma產(chǎn)品,IPTG,卡那霉素,Hepes為 Merck產(chǎn)品,Ni2+純化柱,其余試劑為國產(chǎn)分析純。

高速冷凍離心機(jī) (Beckman,美國),酶標(biāo)儀(SpectraMaxM5,美國),超聲破碎儀 (寧波新藝生物科技股份有限公司)。

1.2 三種維藥石油醚提取物的制備

維藥藥材粉碎后,用 95%的食用酒精冷浸提取,提取液濃縮后得浸膏,浸膏加入少許乙醇后用60～80目硅膠拌樣 (樣品量與硅膠量為 1∶1)。拌樣置于玻璃色譜柱中,以石油醚連續(xù)淋洗。收集淋洗液,濃縮干燥備用。

1.3 人重組蛋白酪氨酸磷酸酶的制備

通過 PCR方法,從 pJ3H-PTP1B(Chermnoff博士惠贈(zèng))上將 PTP1B的活性編碼區(qū) (氨基酸 1-321)克隆到 pET30a(+)。將 pET30a-PTP1B1-321轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)。挑取單個(gè)克隆接種于 5 mL含 50 mg/L卡那霉素的中,37℃250 rpm振蕩過夜培養(yǎng),按 1%將菌液加到 LB液體培養(yǎng)基 (含 50 mg/L卡那霉素),培養(yǎng)至 OD600達(dá) 0.6時(shí),加入 IPTG至終濃度 0.4 mmol/L,誘導(dǎo) 3.5 h。4℃8000 rpm離心 5 min,收集菌體,超聲破碎,取上清進(jìn)行 Ni2+親和層析柱。用 6個(gè)體積的結(jié)合緩沖液洗柱,用 4個(gè)體積的洗滌緩沖液洗柱,用不同濃度的咪唑洗脫,收集蛋白,濃縮后備用。

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,采用 Bradford法測定所收集蛋白的含量。應(yīng)用 S DS-PAGE(堆積膠濃度為 5%,分離膠濃度為 12%)測定 his-PTP1B1-321。

1.4 提取物對 PTP1B活性抑制作用的測定

采用微量法測定 PTP1B活性[5],略作修改。PTP1B活性測定反應(yīng)體系:5 mmol/L pNPP,0.09 μmol/L his-PTP1B1-321,緩沖液 (包括 20 mmol/L HEPES,150 mmol/L NaCl,and 1 mmol/L EDTA(pH 7.0)),總體積為 100μL。室溫孵育 10 min,再加入 pNPP,室溫孵育 30 min后,用 3 mol/L NaOH終止反應(yīng)。在 405 nm處測定吸收值,以不含酶溶液體系為空白。

按上述活性測定方法,提取物用 DMSO溶解,按不同劑量加入,405 nm處測定吸收值,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。按抑制率=(OD405空白-OD405樣品)/OD405空白×100%,求得不同濃度的抑制率。應(yīng)用Origin軟件計(jì)算 IC50值。

1.5 提取物對酶促反應(yīng)的抑制類型的確定

在 3個(gè)濃度水平上,改變底物濃度,測定反應(yīng)的速度,重復(fù) 3次,取均值利用雙倒數(shù)作圖法 (Lineweaver-Burk plots)確定抑制類型。同理,在測定混合型抑制劑的Ki′時(shí),在三個(gè)底物濃度水平上,改變抑制劑濃度,測定反應(yīng)的速度,重復(fù) 3次,取均值利用雙倒數(shù)作圖法 Dixon或 Cornish-Bowden作圖法求組份對酶的抑制常數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用雙倒數(shù)作圖法確定抑制劑對酶促反應(yīng)的抑制類型。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)抑制類型的不同,應(yīng)用不同的作圖求Ki值,即 (1)非競爭性抑制,則用 Dixon作圖法(以抑制劑的濃度對反應(yīng)速度的倒數(shù)作圖)求Ki;(2)反競爭性抑制,Cornish-Bowden作圖法(以抑制劑濃度對反應(yīng)速度的倒數(shù)作圖)求Ki;(3)混合型抑制有兩個(gè)抑制常數(shù)Ki,Ki′,所以用 Dixon作圖法求Ki,同時(shí)用 Cornish-Bowden作圖法求得抑制常數(shù)Ki′。

2 結(jié)果

2.1 人重組蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(his-PTP1B1-321)的制備及活性檢測

將含有 pET30a-PTP1B1-321的重組菌株接種于含卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中,IPTG誘導(dǎo)后,超聲破碎,收集上清,Ni2+親和層析柱進(jìn)行純化,用不同離子濃度的洗脫液進(jìn)行洗脫,在咪唑濃度為 100 mmol/L時(shí)洗脫液中目的蛋白的濃度較高,純度較好,可獲得單一蛋白條帶。重組 PTP1B為 N端帶有 6個(gè)組氨酸標(biāo)記的融合蛋白,預(yù)期分子量為 40.8 kDa。his-PTP1B1-321的平均得率為 0.4 mg/mL。NaVO3在 1 mmol/L下可完全抑制 his-PTP1B1-321的活性。

2.2 三種維藥提取物對 PTP1B活性的影響

以 pNPP為底物,NaVO3作為陽性對照,測定his-PTP1B1-321的活性。用 DMSO溶解 3種維藥提取物,配成不同濃度,按上述方法檢測其對 PTP1B抑制作用。結(jié)果顯示,3種維藥提取物對 his-PTP1B1-321的作用具有濃度相關(guān)性。驅(qū)蟲斑鳩菊石油醚部位對 PTP1B的抑制活性最強(qiáng),其 I C50為 9.4μg/mL,芳香新塔花提取物抑制活性相對較弱,IC50為 20.2μg/mL(見表 1)。

表1 三種維藥提取物對 PTP1B活性的影響Table 1 Effectof three extracts from Uygur herbson the PTP1B activity

2.3 三種維藥提取物對 PTP1B抑制作用的動(dòng)力學(xué)分析

三種維藥對 his-PTP1B1-321抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明,與空白對照組相比較,沙生蠟菊提取物可使表觀Km值增大,但不影響 PTP1B的Vmax,雙倒數(shù)作圖后,與空白對照組的直線相交于縱軸,提示其對 PTP1B的抑制作用類型屬于競爭性 (圖 1)。芳香新塔花雙倒數(shù)作圖時(shí),在其存在或不存在時(shí)所得直線外推時(shí)與 1/[S]軸相交于同一點(diǎn),表現(xiàn)出Km值沒有變化,說明其抑制作用類型為非競爭性 (圖2)。驅(qū)蟲斑鳩菊提取物在雙倒數(shù)作圖時(shí),直線的交點(diǎn)并不交在 1/[S]軸或 1/v軸上,而是相交于第 II象限,表現(xiàn)出混合型抑制。應(yīng)用 Dixon作圖法,求出驅(qū)蟲斑鳩菊提取物Ki為 0.192,另外,采用 Cornish-Bowden作圖法求另一抑制常數(shù)Ki′為 0.155,表現(xiàn)出Ki＞Ki′,提示其抑制作用類型為混合型中的競爭性抑制 (圖 3和 4)。

3 討論

糖尿病作為一種常見的代謝性疾病,與遺傳因素、生活方式及年齡等因素有關(guān)。繼心血管疾病、癌癥,糖尿病的死亡率位居第三位,是人類重要的“隱性殺手”。糖尿病分為 2類:1型糖尿病和 2型糖尿病,其中 2型糖尿病占 90%以上。我國 2型糖尿患病率從 1996年的 3.21%,上升到 2002年的4.37%,以 0.1%的年增長率遞。表現(xiàn)出糖尿病患病率急劇增加、發(fā)病年齡年輕化以及農(nóng)村城市化的流行病學(xué)特征。因此,尋找治療糖尿病新的藥物,特別是從傳統(tǒng)藥物和植物藥中篩選新的天然活性成分成為一條重要途徑。

圖1 沙生蠟菊提取物對 PTP1B抑制作用類型測定Fig.1 Determination of the inhibitorymode ofH.arenariumon PTP1B

2型糖尿病是以高血糖為特征的全身代謝性疾病。通過降低血糖而達(dá)到控制 2型糖尿病的措施主要有胰島素增敏劑,抑制糖分解及抑制糖生成等。PTP1B屬于蛋白酪氨酸磷酸酶超家族,廣泛分布于肝、肌肉、脂肪等胰島素靶向組織[6]。PTP1B的 N-端為催化結(jié)構(gòu)域,通過富含脯氨酸、無催化活性的C-末端結(jié)構(gòu)域錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),具有較強(qiáng)的去 I R-B和I RS-1磷酸化活性[7-9]。通過 PTP1B的抑制、應(yīng)用抑制性抗體及 PTP1B定點(diǎn)突變等方法,增強(qiáng)了對胰島素的敏感性。PTP1B在調(diào)節(jié)胰島素敏感性和能量代謝過程中具有重要作用。抑制 PTP1B可能有效的解決糖耐量減低和肥胖,PTP1B是發(fā)展抗糖尿病藥物的一個(gè)重要的靶點(diǎn)。

PTP1B在國內(nèi)研究的主要集中在信號通路上以及原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[10],但是把表達(dá)產(chǎn)物直接用于篩選的還比較少見。我們應(yīng)用自己構(gòu)建表達(dá)的表達(dá)載體,純化了 PTP1B用于藥物篩選。從天然植物,特別是具有藥用背景的植物中分離 PTP1B抑制劑是目前研究的熱點(diǎn)[11]。國內(nèi)的蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑主要集中在化學(xué)方面,包括氧化苯胂;釩酸鹽和過釩酸鹽及二氟磷酸甲基基團(tuán)類等,而天然抑制劑篩選方面剛起步。據(jù)報(bào)道中藥丹參的甲醇提取物對 PTP1B有明顯的抑制活性[12]。維醫(yī)藥在 2型糖尿病治療方面具有較好的效果,已應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)篩選出許多靶向糖尿病治療的天然抑制劑,如醛糖還原酶,α-葡萄糖苷酶等[13,14]。本文利用分子生物學(xué)技術(shù)建立 PTP1B體外篩選模型,研究了芳香新塔花、沙生蠟菊、驅(qū)蟲斑鳩菊等三種維藥石油醚提取物的 PTP1B抑制活性,確定三種維藥提取物對PTP1B均有不同程度的抑制活性。同時(shí),根據(jù)動(dòng)力學(xué)分析,確定了三種維藥的抑制作用類型,分別為非競爭性、競爭性及混合型中的競爭性。本研究結(jié)果將為我們從維藥中篩選靶向性強(qiáng)、高效低毒的天然抑制劑提供了新的思路,并為深入進(jìn)行維藥治療糖尿病的藥理學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 Zhang ZY.Protein tyrosine phosphatases:structure and function,substrate specificity,and inhibitor development.Annu Rev Pha rmacol Toxicol,2002,42:209-234.

2 Ramachandran C,Kennedy BP.Protein tyrosine phosphatase1B:a novel target for type 2 diabetes and obesity.Curr TopMed Chem,2003,3:749-757.

3 Klaman LD,Boss O,Peroni OD,et a1.Increased energy expenditure,decreased adiposity and tissue-specificinsulin sensitivity in protein tyrosine phosphatase1B-deficient mice.M ol Cell B iol,2000,20:5479-5489.

4 Zinker BA,Rondinone CM,Trevillyan JM.PTP1B antisense oligonucleotide lower PTP1B protein,normalizes blood glucose,and improves insulin sensitivity in diabetic mice.Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:11357-11362.

5 Hung T M,Hoang DM,Kim JC,et al.Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory by dammaranes from Vietnamese Giao-Co-Lam tea.J Ethnopha rmacol,2009,124:240-245.

6 TonksNK.PTP1B:from the sidelines to the front lines.FEBS Lett,2003,546,140-148.

7 Goldstein BJ.Protein tyrosine phosphatases and the regulation of insulin action.In:LeRoith D,Olefsky JM,Taylor SI,eds.Diabetes mellitus a fundam enta and clinica1 text,2nd ed.Philadelphia:Lippincott;2000.206-217.

8 Goldstein BJ,Bittner-Kowalczyk A,WhiteMF,et al.Tyrosine dephosphorylation and deactivation of insulin receptor substrate-1 by protein tyrosine phosphatase 1B.J B iol Chem,2000,275:4283-4289.

9 Yudushkin IV,Schleifenbaum A,Kinkhabwala A,et al.Livecell imaging of enzyme-substrate interation reveals spatial regulation of PTP1B.Science,2007,315:115-118.

10 Lu YX(魯云霞 ),Li J(李俊 ),Zhang Q(章秋 ),et al.Cloning and expression of human PTP1 B cDNA in E.coli.Chin Pha rmacol Bull(中國藥理學(xué)通報(bào)),2008,24(1):91-95.

11 CuiL,NdintehDT,NaM,et al.Isoprenylated flavonoids from the stem bark of Erythrina abyssinica.J Nat Prod,2007,70:1039-1042.

12 Han Y M,Oh H,NaM,et al.PTP1B inhibitory effectof abietane diterpenes isolated from Salvia miltiorrhiza.B iol Pha rm Bull,2005,28:1795-1797.

13 Wu BLHS M(吾布力哈斯木-艾合買提),Di LXT(迪利夏提-沙德穆罕默德),Ha MLT(哈木拉提-吾甫爾).The clinic observation of 172 patient,which treatment by wei medical.Chin J EthnoMed Ethnopha rm(中國民族醫(yī)藥雜志),2000,6:8-9.

14 Wang YQ(王玉芹),Chen N(陳 娜),AJAKBE(阿吉艾克拜爾-艾薩),et al.Studies on the activev hypoglycemic complex of Cicer arietinum L..Chin Tradit Patent Med(中成藥),2007,12:1832-1834.

Inhibitory Effect of Extracts from Three Uyghur Medicine on the Protein Tyrosine Phosphatase1B Activity

LIU He-pei1,2,DOU Jun2,MA Ji1,XIN Xue-lei2,ZHAO Hai-qing2,A ISA HajiAkber2

1State Key Laboratory Basis of Xinjiang Biological Resources and Genetic engineering,College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urum qi 830046,China;2Xinjiang Key Laboratory of Plant Resources and Natural Products Chem istry,Xinjiang Technological Institute of Physics and Chemistry,Chinese Acade my of Sciences,Urumqi 830011,China

Q946.8;R29;R965.1

A

1001-6880(2011)01-0142-04

2009-09-11 接受日期:2010-04-20

中國科學(xué)院、國家外國專家局創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)國際合作伙伴計(jì)劃,新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(200611109);國家科技支撐計(jì)劃(2007BA I30B03)

＊通訊作者 Tel:86-991-368-0635;E-mail:haji@ms.xjb.ac.cn