高速逆流色譜法分離制備花生殼中的黃酮類(lèi)化合物

牛丹丹,劉彩霞,劉繡華,李明靜＊1河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;

河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,開(kāi)封 475004

高速逆流色譜法分離制備花生殼中的黃酮類(lèi)化合物

牛丹丹1,2,劉彩霞1,2,劉繡華2,李明靜1,2＊1河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;2

河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,開(kāi)封 475004

應(yīng)用高速逆流色譜法首次從花生殼中分離制備了 3種黃酮類(lèi)化合物。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸 (5∶3∶3.5∶5∶0.25,v/v)為兩相溶劑系統(tǒng),在主機(jī)轉(zhuǎn)速 800 r/min、流速 2 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng) 275 nm條件下進(jìn)行分離制備,純度用 HPLC法測(cè)定,各化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振氫譜、碳譜鑒定。結(jié)果表明,100 min內(nèi)從70 mg花生殼粗提物中一步分離制備得到木犀草素 11.0 mg,香葉木素 2.2 mg,5,7-二羥基色原酮 5.2 mg,其純度均達(dá) 96.0%以上。利用該方法可以對(duì)花生殼中的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行快速的分離和純化。

高速逆流色譜;花生殼;木犀草素;香葉木素;5,7-二羥基色原酮

Abstract:Three flavoneswere prepared,isolated and purified from peanut hull by high-speed counter-current chromatography(HSCCC)for the first time.A two-phase solvent system composed of n-hexane:ethyl acetate:methanol:water:acetic acid(5∶3 ∶3.5∶5∶0.25,v/v)was used.The obtained fractionswere analyzed by HPLC and identified byMS,1H and13C NMR.W ithin 100 minute,11.0 mg of luteolin,2.2 mg of dios metin,and 5.2 mg of 5,7-dihydroxychromonewith their purities over 96.0%were obtained from 70 mg crude extractof peanut hull in one-step elution under the conditions of a flow rate of 2.0 mL/min,while the apparatus rotated at 800 r/min and the effluentwas detected at 275 nm.The results indicated thatHSCCC was a powerful technique for the separation and purification of flavones from the peanut hull.

Key words:HSCCC;peanut hull;Luteolin;Dios metin;5,7-dihydroxychromone

花生 (A rachis hypogaeaL.)亦名落花生,長(zhǎng)生果,屬豆科一年生草本科植物。我國(guó)廣泛種植花生,在花生的加工過(guò)程中,每年產(chǎn)生花生殼約 450萬(wàn)噸,其中大部分被當(dāng)作廢棄物,僅有少量被加工成飼料或用于化工原料,資源利用率較低[1]。花生殼中以木犀草素為代表的黃酮類(lèi)化合物具有降低血膽固醇、降血壓、降血脂和擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈等作用,還具有抗氧化、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗菌、消炎、增強(qiáng)免疫和抗腫瘤等藥理活性[2-4]。因此,分離制備花生殼總黃酮中的活性成分對(duì)進(jìn)一步研究黃酮類(lèi)化合物藥效作用機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的天然藥物具有重要的意義。

目前,花生殼的提取分離主要采用柱色譜法,分離周期長(zhǎng),消耗溶劑多,操作復(fù)雜。高速逆流色譜(High-speed countercurrent chromatography,HSCCC)作為一種新型分離純化技術(shù),操作方便、快捷,分離度較高,液-液分配體系選擇廣泛,克服了由固相載體帶來(lái)的樣品結(jié)合、失活、污染等缺點(diǎn)。它已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的分離制備和中草藥的分析鑒定[5,6]。本文采用乙醇提取和 LSA-30型大孔吸附樹(shù)脂從花生殼中得到粗提物,以此粗提物經(jīng)HSCCC一步分離得到木犀草素、香葉木素、5,7-二羥基色原酮 (純度均高于 96.0%),為花生殼進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了一種快速實(shí)用的新方法。目前,尚未見(jiàn) HSCCC分離制備花生殼中的黃酮類(lèi)化合物。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TBE-300A型高速逆流色譜儀 (中國(guó)上海同田生化技術(shù)有限公司);AKTA purifier泵及紫外檢測(cè)系統(tǒng) (美國(guó) GE公司);Agilent 1100 HPLC儀 (美國(guó)Agilent公司);超聲波清洗器 (上海現(xiàn)科儀器有限公司);核磁共振儀 (Bruker AV400);質(zhì)譜儀 (Bruker ESQU IRE-LC);XTS顯微熔點(diǎn)儀 (溫度計(jì)未校正)。

1.2 試劑

正己烷、乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸均為分析純,高效液相色譜所用的甲醇為色譜純,均為天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司;水為二次蒸餾水;LSA-30型大孔吸附樹(shù)脂 (西安藍(lán)曉科技有限公司)。

1.3 材料

花生殼采自河南開(kāi)封近郊,40℃烘干,粉碎,備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 花生殼總黃酮粗提物的制備

取花生殼粉末 300 g,置于 10 L圓底燒瓶中,加入 70%乙醇 7 L,80℃水浴回流提取 3次,每次 2.5 h,抽濾,合并濾液減壓濃縮至無(wú)醇味。將濃縮液經(jīng)LSA-30型大孔吸附樹(shù)脂吸附后,先用蒸餾水淋洗至無(wú)色,除去水溶性雜質(zhì),依次用 30%、50%、70%、95%的乙醇洗脫至三氯化鋁顯色劑無(wú)顏色變化,收集洗脫液經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥,得花生殼粗提物 4 g,備用。

2.2 溶劑體系及樣品溶液的配制

在分液漏斗中配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸 (5∶3∶3.5∶5∶0.25,v/v)兩相溶劑體系 ,充分震搖后在室溫下靜置 12 h。使用前將上相和下相分離,超聲脫氣 30 min,冷卻、待用。稱(chēng)取 70 mg花生殼粗提物,用溶劑體系的上下相各 4 mL超聲溶解樣品,備用。

2.3 高速逆流色譜法分離制備

開(kāi)啟恒溫循環(huán)器,設(shè)定溫度為 25℃,以 10 mL/min的流速將上相 (固定相)泵入主機(jī)管路,當(dāng)有固定相流出時(shí),改用 2 mL/min的流速泵下相 (流動(dòng)相),同時(shí)開(kāi)啟 AKTA purifier檢測(cè)系統(tǒng),按 800 r/min的轉(zhuǎn)速啟動(dòng)主機(jī)。觀察透明容器,待流動(dòng)相以液滴形式穿透固定相,從管柱出口流出,且基線(xiàn)穩(wěn)定后,將樣品溶液由載樣注射器經(jīng)進(jìn)樣圈注入。管柱出口處的流出物經(jīng) AKTA purifier的紫外檢測(cè)器在275 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè),記錄色譜圖,根據(jù)色譜圖收集目標(biāo)成分。

2.4 高效液相色譜分析條件

色譜柱:Agilent Zorbac C18(21 mm×150 mm,5 μm),流動(dòng)相為 0.1%磷酸水溶液和甲醇,梯度洗脫程序?yàn)?20 min內(nèi)甲醇從 35%升至 65%;檢測(cè)波長(zhǎng)為 275 nm;柱溫為 30℃;進(jìn)樣量為 10μL;流速為0.3 mL/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 溶劑系統(tǒng)選擇

在高速逆流色譜中,溶劑體系的選擇至關(guān)重要,合適的溶劑體系是其分離的關(guān)鍵。通常樣品成分在溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)及管柱中固定相能否實(shí)現(xiàn)較高的保留值均會(huì)影響分離效果。根據(jù)色譜理論,利用 HSCCC進(jìn)行樣品分離的必要條件是樣品在互不相溶的兩相中具有合適的分配系數(shù)[7],一般情況下分配系數(shù)在 0.5～2之間,固定相保留值在 50%以上,及兩相溶劑體系分層時(shí)間小于 30 s,能得到滿(mǎn)意的分離效果。分配系數(shù)的測(cè)定,可利用 TLC、HPLC、HPCE來(lái)測(cè)定[8,9],本文采用 TLC和 HPLC測(cè)定。

3.1.1 薄層色譜法 (TLC)

實(shí)驗(yàn)選取乙酸乙酯 -甲醇 -水 、氯仿 -甲醇 -水 、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水三個(gè)體系做為分離的溶劑系統(tǒng)。分別配制不同比例的上述三個(gè)體系,取上下相各 5 mL于 10 mL具塞量瓶中,加入 5 mg花生殼粗提物,超聲溶解,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,靜置分層,用毛細(xì)管取近似等量的上下相于硅膠薄層板上,以氯仿-乙酸乙酯-冰醋酸 (1∶1∶0.02,v/v)為展開(kāi)劑,展開(kāi),碘顯色。薄層色譜的分析結(jié)果表明:溶劑體系為乙酸乙酯 -甲醇 -水 (2∶1∶1,v/v)時(shí) ,目標(biāo)化合物基本集中在下相甲醇和水的體系中,不符合溶劑體系選擇的一般要求;溶劑體系為氯仿-甲醇-水 (3∶4∶2,v/v),正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 (5∶3∶3.5∶5,v/v)時(shí) ,目標(biāo)化合物在溶劑體系的上下相中溶解程度相近。通過(guò)薄層色譜對(duì)溶劑體系的初步篩選確定氯仿-甲醇 -水 (3∶4∶2,v/v),正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 (5∶3∶3.5∶5,v/v)為分離體系。

3.1.2 高效液相色譜法 (HPLC)

用 HPLC測(cè)定 3.1.1條件下確定的兩個(gè)體系的分配系數(shù):稱(chēng)取適量的花生殼粗提物置于 5 mL試管中 ,分別加入氯仿 -甲醇 -水 (3∶4∶2,v/v),正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 (5∶3∶3.5∶5,v/v)兩體系的上下相各 1 mL,超聲使樣品充分溶解,靜置平衡,取上下相各 0.2 mL,離心濃縮干,用色譜級(jí)甲醇溶解,經(jīng)HPLC檢測(cè),并計(jì)算出各目標(biāo)化合物的分配系數(shù) (K=Aupper/Alower,A為目標(biāo)峰面積),結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 3種黃酮類(lèi)化合物在兩種溶劑體系中的分配系數(shù)(K)Table 1 The K(Partition coefficients)valuesof 3 flavones(1-3)in tow solvent systems

由表 1可知,樣品在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶3∶3.5∶5,v/v)溶劑體系中的分配系數(shù)在 0.5～2范圍內(nèi),通過(guò) HSCCC預(yù)分離后,3種化合物可以分離,但分離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在正己烷-乙酸乙酯 -甲醇 -水 (5∶3∶3.5∶5,v/v)體系中加入一定比例的冰醋酸,可以改善分離效果。當(dāng)實(shí)驗(yàn)改為正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 -冰醋酸 (5∶3∶3.5∶5∶0.25,v/v)體系分離時(shí),3種化合物分離較好,固定相保留率為 65%,分離時(shí)間適中。實(shí)驗(yàn)表明,由于所分離黃酮類(lèi)化合物分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基,在體系中加入少量的酸,讓目標(biāo)樣品不電離增加有機(jī)性,從而可以改善分離效果[10,11]。因此,確定正己烷-乙酸乙酯 -甲醇 -水 -冰醋酸 (5∶3∶3.5∶5∶0.25,v/v)為最終使用體系。

3.2 HSCCC分離參數(shù)的考察

3.2.1 樣品溶劑量的考察

實(shí)驗(yàn)采用等體積的上下相進(jìn)行樣品的溶解,分別考察了總體積為 (5、6、7、8、9、10 mL)溶劑量溶解70 mg花生殼粗提物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:當(dāng)溶劑量小于 8 mL時(shí)有部分被分離物質(zhì)不溶;當(dāng)溶劑量大于 8 mL時(shí),雖然被分離物質(zhì)能夠很好的被溶解,但是在進(jìn)行 HSCCC分離過(guò)程中會(huì)有固定相的流失,故采用總體積為 8 mL的溶劑量作為最佳溶劑量。

3.2.2 進(jìn)樣量的考察

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)還考察了不同的上樣量 (50、60、70、80 mg),當(dāng)上樣量大于 70 mg時(shí),選用 3.2.1條件下確定溶劑用量時(shí),不能使被分離物質(zhì)徹底溶解。因此,體系進(jìn)樣量不超過(guò) 70 mg為宜。

3.3 HSCCC分離制備的結(jié)果

按“2.3”節(jié)操作方法 100 min內(nèi)經(jīng) HSCCC分離制備得到 3個(gè)化合物 (見(jiàn)圖 1中 1、2、3)。結(jié)果顯示,從 70 mg花生殼粗提物中一次分離得到化合物1(11.0 mg),化合物 2(2.2 mg),化合物 3(5.2 mg)。而且,此法分離時(shí)間短,可以采用連續(xù)進(jìn)樣方式來(lái)制備此三種化合物。

圖1 花生殼粗提物高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC chromatogram of crude extract from peanut hull

圖2 (a)花生殼粗提物、(b)木犀草素、(c)香葉木素和 (d)5,7-二羥基色原酮的 HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of(a)the crude extract of peanut hull,(b)luteolin,(c)dios metin,and(d)5,7-dihydroxychromone

3.4 純度分析

采用“2.4”節(jié)的條件對(duì)高速逆流色譜所得到的化合物 1、2、3進(jìn)行 HPLC檢測(cè)分析,經(jīng)峰面積歸一化法計(jì)算可知純度均大于 96.0%,如圖 2所示。

3.5 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 (1) 為黃色粉末,mp.327～329℃,EI-MSm/z:286[M]+,分子式為 C15H10O6。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.41(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6′),7.39(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.87(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.66(1H,s,H-3),6.43(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.19(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),12.97(1H,s,OH-5),10.75(1H,s,OH-7),9.91(1H,s,OH-3′),9.41(1H,s,OH-4′);13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:164.3(C-2),103.3(C-3),182.1(C-4),157.5(C-5),99.3(C-6),164.4(C-7),94.3(C-8),161.9(C-9),104.2(C-10),122.0(C-1′),113.8(C-2′),146.2(C-3′),150.2(C-4′),116.5(C-5′),119.4(C-6′)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的木犀草素一致,故鑒定該化合物為木犀草素。

化合物 (2) 為黃色粉末,mp.256～258℃,EI-MSm/z:300[M]+,分子式為 C16H12O6。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.55(1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),7.65(1H,dd,J=8.2,2.1 Hz,H-6′),6.92(1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.90(1H,s,H-3),6.50(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.20(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),13.0(1H,s,OH-5),10.8(1H,s,OH-7),9.50(1H,s,OH-3′);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:163.9(C-2),104.0(C-3),181.9(C-4),157.8(C-5),99.5(C-6),164.6(C-7),94.63(C-8),161.9(C-9),103.6(C-10),119.8(C-1′),113.10(C-2′),148.52(C-3′),151.2(C-4′),116.40(C-5′),121.0(C-6′),56.0(OCH3)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的香葉木素一致,故鑒定該化合物為香葉木素。

化合物 (3) 為黃色粉末,mp.270～272℃,EI-MSm/z:178[M]+,分子式為 C9H6O4。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:12.6(1H,s,OH-5),10.88(1H,s,OH-7),8.16(1H,d,J=610 Hz,H-2),6.26(1H,d,J=610 Hz,H-3),6.18(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.34(1H,d,J=2.1 Hz,H-8).13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:157.3(C-2),110.4(C-3),181.6(C-4),162.0(C-5),99.1(C-6),165.5(C-7),94.0(C-8),157.8(C-9),104.7(C-10)。以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道 5,7-二羥基色原酮一致,故鑒定該化合物為 5,7-二羥基色原酮。

4 結(jié)論

本文應(yīng)用高速逆流色譜法首次從花生殼粗提物中一步分離制備了木犀草素、香葉木素、5,7-二羥基色原酮三種黃酮類(lèi)化合物,均達(dá)到較好的分離和純化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HSCCC可以從粗提物中一次分離得到多個(gè)純度較高的單體,并且可以連續(xù)進(jìn)樣,分離周期短、操作快捷、簡(jiǎn)便,對(duì)于分離得到的樣品可應(yīng)用于制備對(duì)照品,研究中藥材化學(xué)成分以及新藥開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。高速逆流色譜在天然產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),必將促進(jìn)現(xiàn)代分離技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展。

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Preparative Separation of Flavones from Peanut Hull by High-Speed Counter-Current Chromatography

N IU Dan-dan1,2,L IU Cai-xia1,2,L IU Xiu-hua2,L IMing-jing1,2＊1College of Che mistry and Chemical Engineering,Henan University,Kaifeng 475004,China;2

Key Laboratory of NaturalMedicine and Immunology Engineering Henan Province,Kaifeng 475004,China

R284.2;Q946.91

A

1001-6880(2011)01-0110-05

2009-10-20 接受日期:2009-12-29

河南省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目 (200510475040)

＊通訊作者 Tel:86-378-5918398;E-mail:lmjhellen6@163.com