N-酰化低聚殼聚糖衍生物還原能力的研究

孫 濤,銀旭紅,康永峰,邵則淮,翁文榮

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306

N-酰化低聚殼聚糖衍生物還原能力的研究

孫 濤＊,銀旭紅,康永峰,邵則淮,翁文榮

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306

對(duì)低聚殼聚糖進(jìn)行N-酰化改性,制得取代度相同的N-馬來(lái)酰低聚殼聚糖 (NMCOS),N-琥珀酰低聚殼聚糖 (NSCOS),N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖 (NPCOS),其中 NMCOS1、NSCOS1、NPCOS1的取代度均為 0.25;NMCOS2、NSCOS2、NPCOS2的取代度均為 0.49。考察了 6種N-酰化低聚殼聚糖衍生物的還原能力。結(jié)果表明:當(dāng)取代度相同時(shí),N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖的還原能力最強(qiáng),其次是N-馬來(lái)酰低聚殼聚糖,N-琥珀酰低聚殼聚糖的還原能力最差。這可能是由取代基的性質(zhì)不同所致。

低聚殼聚糖;N-酰化;取代度;還原能力

Abstract:N-maleoyl chitosan oligosaccharide(NMCOS),N-succinyl chitosan oligosaccharide(NSCOS)andN-phthaloyl chitosan oligosaccharide(NPCOS)with the same substituting degree were prepared byN-acylation of chitosan oligosaccharide.The substituting degrees of NMCOS1,NSCOS1 and NPCOS1 were 0.25.The substituting degrees of NMCOS2,NSCOS2,and NPCOS2 were 0.49.Their power reducing were evaluated and the results showed the order of the power reducing of theN-acyl chitosan oligosaccharide with the same substituting degrees isNPCOS＞NMCOS＞NSCOS.Thatmay be related to the properties of the substituting groups.

Key words:chitosan oligosaccharide;N-acyl;substituting degree;power reducing

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

低聚殼聚糖 (浙江金殼生物化學(xué)有限公司,凝膠色譜測(cè)定其分子量為 5000 Da,脫乙酰度為95%);其余試劑均為分析純,購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司;抗氧化測(cè)試所需溶液由二次蒸餾水配制。磁力攪拌器,pH計(jì),分光光度計(jì),電導(dǎo)率儀,EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀,Waters 515型凝膠色譜儀。

1.2 N-酰化低聚殼聚糖的制備

1.2.1 N-馬來(lái) (鄰苯二甲)酰低聚殼聚糖的制備

稱(chēng)取兩份 5.0 g低聚殼聚糖分別加入 100.0 mL蒸餾水溶解,攪拌溶解,分別稱(chēng)取 1.0和 1.5 g的馬來(lái)酸酐 (0.5 g和 2.5 g鄰苯二甲酸酐),用 20.0 mL丙酮溶解,然后緩慢加入反應(yīng)器,在室溫下攪拌反應(yīng)15 h,然后用丙酮沉淀,過(guò)濾,產(chǎn)物用丙酮反復(fù)洗滌,最后在 60℃烘干,得到 NMCOS1和 NMCOS2(NPCOS1和 NPCOS2)[5]。

低聚殼聚糖是甲殼素 /殼聚糖的降解產(chǎn)物,它能溶于水。低聚殼聚糖分子結(jié)構(gòu)上有大量的氨基和羥基,具有優(yōu)良的抗氧化活性[1,2]。同時(shí)它也可以進(jìn)行多種化學(xué)改性。酰化改性是低聚殼聚糖的一種重要改性方式,既可以在羥基位上反應(yīng) (O-酰化)生成酯,也可以在氨基上反應(yīng) (N-酰化)生成酰胺。由于氨基的反應(yīng)活性比羥基強(qiáng),酰化反應(yīng)易發(fā)生N-酰化反應(yīng)[3]。N-取代基結(jié)構(gòu)和取代度對(duì)N-酰基低聚殼聚糖的性能有重要的的影響,但是有關(guān)他們之間關(guān)系的研究,尚未見(jiàn)很多報(bào)道。

還原能力是評(píng)定抗氧劑活性的重要指標(biāo)[4]。本文制備了取代度相同的N-琥珀酰,N-馬來(lái)酰和N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖,研究了取代基團(tuán)對(duì)還原能力的影響。本研究為低聚殼聚糖化學(xué)改性的進(jìn)一步研究提理論基礎(chǔ)。

1.2.2 N-琥珀酰低聚殼聚糖制備

參照文獻(xiàn)并稍做改進(jìn),稱(chēng)取兩份 5.0 g低聚殼聚糖分別溶于 100 mL水中,然后轉(zhuǎn)移到一個(gè)細(xì)頸瓶中,分別稱(chēng)取 1.0和 2.5 g琥珀酸酐溶解于 50 mL丙酮中,在室溫下,30 min中內(nèi)緩慢加到細(xì)頸瓶中,然后在 40℃溫度下反應(yīng) 4 h,反應(yīng)完畢后,冷卻至室溫,用過(guò)量的丙酮沉淀,過(guò)濾,產(chǎn)物用丙酮反復(fù)洗滌,最后產(chǎn)物在 40℃真空干燥 24 h,得到白色的N-琥珀酰低聚殼聚糖 NSCOS1和 NSCOS2[6]。

1.3 結(jié)構(gòu)表征

1.3.1 紅外光譜

紅外光譜在 EQUNOX55傅立葉紅外-拉曼光譜儀上進(jìn)行,采用 KBr壓片法制樣,測(cè)定波數(shù)范圍為500～4000 cm-1,分辨率為 0.8 cm-1。

1.3.2 分子量的測(cè)定

凝膠色譜法測(cè)定N-酰化低聚殼聚糖衍生物的平均分子量大小。測(cè)試條件如下:柱子:TOSOH B IOSEP TSK-Gel G4000S WXL(7.8×300 mm,Made in Japan);流動(dòng)相:0.2 M醋酸鈉和醋酸緩沖溶液,pH=4.8;色譜儀:Waters 515型凝膠色譜儀,檢測(cè)器:Waters 2410示差折光檢測(cè)器 (美國(guó) Waters公司);進(jìn)樣量:50μL;柱溫:40℃;標(biāo)準(zhǔn)品:葡聚糖,平均分子量分別是 413000(Da),188000(Da),76900(Da),43200(Da),10500(Da)。

1.3.3 取代度的測(cè)定[7]

準(zhǔn)確稱(chēng)量樣品 0.1000 g置 500 mL燒杯內(nèi),準(zhǔn)確加入 0.1038 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液 20.00 mL溶解樣品,再加入去離子水 200 mL稀釋、混勻,用0.4685 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液返滴,測(cè)定電導(dǎo)率值。做電導(dǎo)率-氫氧化鈉體積關(guān)系圖,添加趨勢(shì)線,求其回歸方程,按下式計(jì)算N-酰化低聚殼聚糖的取代度:X=C1V1-C2V2;161X+203Y+262Z=m;(X+Z)/(X+Y+Z)=DD;Z/(X+Y+Z)=DS。其中C1,C2分別為 HCl和 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度 (mol/L);V1為移取 HCl的體積,V2為滴定至第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)處消耗 NaOH的體積;X為N-酰化殼聚糖中脫乙酰但未取代單元 (相對(duì)分子質(zhì)量 161)的數(shù)量;Y為未脫乙酰單元 (相對(duì)分子量為 203)的數(shù)量;Z為酰化單元 (琥珀酰化,馬來(lái)酰化,鄰苯二甲酰化的相對(duì)分子質(zhì)量分別是 262,260,310);m為樣品質(zhì)量(mg),DD為殼聚糖的脫乙酰度;DS為N-酰化低聚殼聚糖的取代度。

1.4 還原能力的測(cè)定

還原能力根據(jù)文獻(xiàn)[8]測(cè)定并稍做改進(jìn)。取 2.0 mL不同濃度的樣品,加入 pH=6.60的 0.2 mol/L磷酸緩沖液 1%鐵氰化鉀溶液各 2.5 mL,混勻,50℃水浴 20 min后迅速冷卻,加入 2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,混勻后在 3000 r/min下離心 10 min,取上清液 2.0 mL,加入 2.5 mL去離子水和 0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液,靜置十分鐘后在 700 nm處測(cè)定吸光度。吸光度越高,表明還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

圖1 COS及其N(xiāo)-酰化衍生物的紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of COS and itsN-acyl derivatives

圖1 是低聚殼聚糖及其N(xiāo)-酰化衍生物的紅外圖。由圖上可以看出,低聚殼聚糖及其N(xiāo)-酰化衍生物都在 1155,1073,1030,894 cm-1附近都有強(qiáng)吸收峰。這組較強(qiáng)峰是判定低聚殼聚糖及其衍生物存在的特征吸收峰[9]。

NMCOS中 1640 cm-1為烯烴的 VC=C振動(dòng)峰;1707 cm-1附近出現(xiàn)為不飽和羧基因共軛作用的 C=O振動(dòng)吸收峰;860 cm-1附近為雙鍵中 C-H面外振動(dòng)吸收峰,在低聚殼聚糖未見(jiàn)此峰,這些峰證實(shí)了NMCOS中馬來(lái)酸基的存在[6]。在 NPCOS中,1640 cm-1為烯烴的 VC=C振動(dòng)峰;在 750 cm-1附近的吸收峰為鄰二取代苯的δAr-H面外彎曲振動(dòng)峰這些峰證明了鄰苯二甲酸基的存在[10]。在 NSCOS中,1400～1200 cm-1的吸收峰是琥珀酸碳結(jié)構(gòu)的振動(dòng)峰,這證明了 NSCOS中琥珀酸基的存在[11,12]。NMCOS、NPCOS和 NSCOS在 1560 cm-1附近的仲酰胺的δNH振動(dòng)峰在衍生物中明顯增大,同時(shí)在 1320 cm-1附近出現(xiàn) VC-N伸縮振動(dòng)峰,并且在 1073和1023 cm-1處的 C3仲羥基和 C6伯羥基的 C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰與殼聚糖相比沒(méi)有明顯變化,這均證明反應(yīng)發(fā)生在氨基上[13]。

凝膠色譜法測(cè)得 NPCOS1、NMCOS1和 NSCOS1

的分子量分別為 5829、5733和 5772,NPCOS2、NMCOS2、NSCOS2的分子量分別為 6939、6310和6437。電導(dǎo)滴定法測(cè)定取代度 NPCOS1、NMCOS1、NSCOS1的取代度均為 0.25,NPCOS2、NMCOS2、NSCOS2的取代度均為 0.49。

2.2 還原能力

還原能力與抗氧化能力之間有著密切的關(guān)系[14]。圖 2是取代度為 0.25的 NPCOS1、NMCSO1和 NSCOS1的還原能力曲線圖。由圖可知,隨著樣品濃度的升高,還原能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度為 0.4 mmol/L時(shí) ,NPCOS1、NMCOS1和 NSCOS1的吸光值分別是 0.52、0.48和 0.43。NPCOS1、NMCSO1和NSCOS1的還原能力大小順序依次為 NPCOS1＞NMCOS1＞NSCOS1。圖 3是取代度為 0.49的NPCOS2、NMCOS2和 NSCOS2還原能力曲線圖。當(dāng)濃度為 0.4 mmol/L時(shí),NPCOS2、NMCOS2和 NSCOS2的吸光值分別是 0.57、0.49和 0.44,與取代度為 0.25時(shí)一樣,NPCOS2、NMCOS2和 NSCOS2的還原能力大小為 NPCOS2＞NMCOS2＞NSCOS2。隨著取代度的升高,NPCOS的還原能力始終最強(qiáng),其次是 NMCOS,NSCOS的還原能力最差。

抗氧化物質(zhì)通過(guò)提供電子阻斷 Fe2+向 Fe3+轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)出一定的還原能力。低聚殼聚糖主要是由單元分子結(jié)構(gòu)上的氨基和羥基提供電子阻斷 Fe2+向 Fe3+轉(zhuǎn)變。當(dāng)?shù)途蹥ぞ厶前l(fā)生N-酰化后,其部分氨基被取代基取代。取代度相同,羥基和殘余氨基數(shù)目相同。他們還原能力的差異可能是由取代基不同所致。

NPCOS、NMCOS和 NSCOS是在殼聚糖上的氨基位上分別引進(jìn)-COC6H4COO–、-COCH=CHCOO–和-COCH2CH2COO–,這三種取代基團(tuán)都是吸電子基團(tuán),它們能降低聚殼聚糖分子結(jié)構(gòu)的電子云密度,使分子內(nèi)、分子間生成氫鍵的幾率降低,從而增強(qiáng)氨基和羥基的活性,供氫能力增強(qiáng),有利于還原能力。三種取代基的吸電子能力大小順序依次為:-COC6H4COO–＞-COCH = CHCOO–＞ -COCH2CH2COO–,故他們的還原能力大小為NPCOS ＞NMCOS ＞NSCOS。

3 結(jié)論

本文通過(guò)合成相同取代度的N-馬來(lái)酰低聚殼聚糖、N-琥珀酰低聚殼聚糖和N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖,并通過(guò)考察其還原能力,研究了取代基團(tuán)對(duì)低聚殼聚糖還原能力的影響。結(jié)果表明,取代度相同時(shí),N-鄰苯二甲酰低聚殼聚糖的還原能力始終最強(qiáng),其次是N-馬來(lái)酰低聚殼聚糖,再次是N-琥珀酰低聚殼聚糖,這是由于取代基的性質(zhì)不同所致,吸電子效應(yīng)鄰苯酰基 ＞馬來(lái)酰基 ＞琥珀酰基。本實(shí)驗(yàn)對(duì)低聚殼聚糖的選擇性功能化提供了新的思路。

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Power Reducing ofN-acyl Chitosan O ligosaccharide

SUN Tao＊,Y IN Xu-hong,KANG Yong-feng,SHAO Ze-huai,WENGWen-rong
College of Food Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306

Q58;R284.3;TS202.3

A

1001-6880(2011)01-0098-04

2009-06-15 接受日期:2009-09-02

上海市教育委員會(huì)科研項(xiàng)目 (07ZZ134);上海市教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目專(zhuān)項(xiàng)基金(J50704)

＊通訊作者 Tel:86-21-61900363;E-mail:taosun@shou.edu.cn