補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)增殖、氧化應(yīng)激及 I型膠原分泌的影響

郭 敏,李佃貴,王建華,高紹芳,張 紈,張紅蓮

1河北醫(yī)科大學(xué)研究生院,石家莊 050017;2河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院消化內(nèi)科,石家莊 050011;3河北醫(yī)科大學(xué)天然藥物教研室,石家莊 050017;4石家莊衛(wèi)生學(xué)校,石家莊 050017

補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)增殖、氧化應(yīng)激及 I型膠原分泌的影響

郭 敏1,李佃貴2＊,王建華3,高紹芳4,張 紈1,張紅蓮1

1河北醫(yī)科大學(xué)研究生院,石家莊 050017;2河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院消化內(nèi)科,石家莊 050011;3河北醫(yī)科大學(xué)天然藥物教研室,石家莊 050017;4石家莊衛(wèi)生學(xué)校,石家莊 050017

通過(guò)研究植物雌激素香豆素補(bǔ)骨脂素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞 HSC-T6增殖及相關(guān)因子表達(dá)的影響,為補(bǔ)骨脂素治療肝纖維化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。常規(guī)培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞 HSC-T6,采用 0.1 mmol/L的 H2O2制造HSC-T6氧化應(yīng)激的模型。分別用MTT法檢測(cè)肝星狀細(xì)胞增殖、放射免疫法檢測(cè)細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛 (MDA),還原性谷胱甘肽 (GSH),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px)的活性和含量,EL ISA法測(cè)定 I型膠原的分泌。結(jié)果表明:與正常對(duì)照組組比較,補(bǔ)骨脂素在濃度為 10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L,均呈現(xiàn)出抑制 HSC-T6增殖的作用 (P＜0.05),且最佳作用時(shí)間為 48 h(P＜0.05);與模型組比較,補(bǔ)骨脂素各個(gè)濃度組能夠提高 SOD和 GSH-Px的活性 (P＜0.05),并降低細(xì)胞上清液中MDA和 GSH的含量 (P＜0.05);與模型組比較,補(bǔ)骨脂素各個(gè)濃度組在作用 48 h后,細(xì)胞上清液中的 I型膠原的表達(dá)量均降低 (P＜0.05)。因此,作為植物雌激素的一種,補(bǔ)骨脂素能有效的抑制 HSC-T6的增殖及抗 HSC-T6氧化應(yīng)激,很可能成為雌激素的替代品在治療肝纖維化中。

肝纖維化;肝星狀細(xì)胞;補(bǔ)骨脂素;植物雌激素;氧化應(yīng)激

Abstract:To investigate the effect of psoralen on the proliferation and correlated factors of hepatic stellate cells(HSCT6)in vitro.Psoralen was dissolved in d imethyl sulphoxide(DMSO)at different concentrations of 10μmmol/L,1 μmmol/L,0.1μmmol/L,and 0.01μmmol/L.The cell proliferation was assessed with methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)after incubation with psoralen for 24 h,48 h,and 72 h,respectively.HSC-T6 were divided into 5 groups and incubated in the presence of 0.1 mol/L hydrogen dioxide followed by washing with PBS for 3 times.Psoralen at different concentrations(10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L)was added into the cell culture media,and after incubation for 48 h,the activities or levels of superoxide dis mutase(SOD),malonaldehyde(MDA),glutathione(GSH),glutathione peroxidase(GSH-Px),and collagen I(COL I)in the supernatant of the cell culture were measured.The results showed that psoralen inhibited the cell proliferation at the concentration of 10,1,and 0.1μmol/L.Psoralen significantly decreased the production of extracellularMDA,GSH,and COL I and increased SOD and GSH-Px activity.Therefore,psoralen can inhibit the proliferation of HSC-T6,decrease lipid peroxidation in HSC-T6,and degrade the secretion from COL I in HSC-T6.

Key words:liver fibrosis;hepatic stellate cells;psoralen;phytoestrogen;oxidative stress

流行病學(xué)調(diào)查顯示,患有乙型肝炎的女性患者發(fā)展成肝纖維化甚至肝硬化的幾率比男性患者低得多,且多發(fā)生在絕經(jīng)后,育齡期婦女很少有發(fā)生肝纖維化或是肝硬化[1]。其機(jī)制可能與雌激素和肝臟雌激素受體在不同性別分布及存在差異有關(guān)。研究顯示,由四氯化碳 (CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠經(jīng)過(guò)雌激素治療后,血清透明質(zhì)酸 (HA)和Ⅳ型膠原(C IV)水平下降,肝臟膠原沉積受到抑制,一型膠原合成較少,平滑肌肌動(dòng)蛋白 (α-S MA)陽(yáng)性的 HSC數(shù)量降低,從而抑制了大鼠肝纖維化的發(fā)生[2]。但是雌激素療法易引起嚴(yán)重的副作用,植物雌激素包括黃酮類(lèi),香豆素類(lèi),木脂素類(lèi)等,因其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性與雌激素相似,且沒(méi)有雌激素所有的副作用,近年來(lái)備受關(guān)注。現(xiàn)在研究大都關(guān)注黃酮類(lèi)化合物對(duì)肝纖維化的治療作用[3],而同屬于植物雌激素的香豆素類(lèi)化合物研究甚少。以往研究表明,在治療某些疾病時(shí)香豆素類(lèi)化合物表現(xiàn)出比黃酮類(lèi)化合物更好的療效[4],推測(cè)屬于香豆素類(lèi)化合物補(bǔ)骨脂素也可能具有與黃酮類(lèi)相似的抗肝纖維化的作用,在本實(shí)驗(yàn)中初步加以證實(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

HSC-T6細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所惠贈(zèng),為活化性永生的大鼠肝星狀細(xì)胞系。

1.1.2 儀器與試劑

補(bǔ)骨脂素 (溶于 DMSO備用,由中國(guó)藥檢所提供,批號(hào) 110739-200309);噻唑藍(lán) (MTT,Sigma公司雙抗,華北制藥廠);DMEM高糖培養(yǎng)基 (G IBCO公司);胎牛血清 FBS(北京燕生科技有限公司);I型膠原 EL ISA試劑盒 (美國(guó) biotech公司);細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶 (SOD);丙二醛 (MDA);還原性谷胱甘肽 (GSH);谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px)試劑盒 (南京建成生物研究所);CO2培養(yǎng)箱 (美國(guó)NATURE);XDS-1B型倒置顯微鏡 (OLY MPUS);TECAN酶標(biāo)儀 (奧地利)。

1.2 方法

1.2.1 肝星狀細(xì)胞 (HSC-T6)的培養(yǎng)及分組

將 HSC-T6細(xì)胞從液氮中取出,迅速置于 37℃水浴箱中 1 min內(nèi)使其融化,無(wú)菌條件下打開(kāi)凍存管,將細(xì)胞及其凍存液一起轉(zhuǎn)入已滅菌的盛有 10 mL 20%FBS-DMEM(高糖)培養(yǎng)基的離心管中,1500 r/min離心 5 min,棄上清,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 3 mL 20%FBS-DMEM的培養(yǎng)瓶中置于 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中。24 h后進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。共分為 6組:空白對(duì)照組,模型組,補(bǔ) 1(補(bǔ)骨脂素濃度 10μmol/L,P1),補(bǔ) 2(補(bǔ)骨脂素濃度 1μmol/L,P2),補(bǔ) 3(補(bǔ)骨脂素濃度 0.1 μmol/L,P3),補(bǔ) 4(補(bǔ)骨脂素濃度 0.01μmol/L,P4)。

1.2.2 MTT法測(cè)補(bǔ)骨脂素對(duì) HSC增殖的影響

取待傳代的 HSC用 10%FBS-DMEM培養(yǎng)基稀釋成 2×104cell/mL接種到 96孔培養(yǎng)板中,每孔200μL,待細(xì)胞貼壁后,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合約70%左右,換為不含血清的高糖 DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。24 h后更換為用 1%FBSDME M培養(yǎng)基稀釋的補(bǔ)骨脂素 (濃度為 10μmol/L,1 μmol/L,0.1μmol/L,0.01μmol/L),分別在培養(yǎng) 24 h,48 h,72 h后 ,加入 5 mg/mL MTT,20μL/孔 ,于 37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h,吸棄培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜 (DMS O)150μL/孔,震搖溶解 10 min后,用酶標(biāo)儀測(cè)定 492 nm的光吸收度(OD)值。

1.2.3 造模及分組

取待傳代的 HSC-T6用 10%FBS-DMEM培養(yǎng)基稀釋成 2×104/mL密度接種到 96孔培養(yǎng)板中,每孔 200μL,待細(xì)胞貼壁后,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合約70%左右,換為不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。培養(yǎng)細(xì)胞用 PBS洗 3遍,用終濃度為 0.1 mmol/L H2O2共同孵育 2 h,用PBS洗 3遍,然后進(jìn)行分組:(1)模型組,加入 1%FBS-DMEM(無(wú)酚紅)培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)補(bǔ)骨脂素組,加入終濃度為 10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L的補(bǔ)骨脂素孵育。(3)空白對(duì)照組,即在未用 0.1 mmol/L H2O2處理過(guò)的 HSC-T6中加入加入 1%FBS-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設(shè) 8個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 SOD、MDA含量和 GSH、GSH-Px活性測(cè)定

在分組的基礎(chǔ)上繼續(xù)培養(yǎng) 48 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液,按照放免試劑盒方法檢測(cè)。

1.2.5 EL ISA法檢測(cè) HSC-T6培養(yǎng)上清液中 I型膠原含量

在分組的基礎(chǔ)上繼續(xù)培養(yǎng) 48 h,收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液,包被于 96孔 EL ISA板,依次加入兔抗大鼠 I型膠原抗體、綿羊抗兔 IgG-HRP、鄰苯二胺,按照試劑盒說(shuō)明,用酶標(biāo)儀測(cè)定 492 nm的光吸收度(A)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用 SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件,所有數(shù)據(jù)均以表示,多組間均數(shù)比較采用方差分析,均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)骨脂素對(duì) HSC-T6增殖的影響 (表 1)

HSC-T6在不同濃度補(bǔ)骨脂素培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h,只有 10μmol/L有抑制其增殖的作用 (F=33.04,P＜0.01);培養(yǎng) 48 h后,補(bǔ)骨脂素 10μmol/L,1μmol/L和 0.1μmol/L均有明顯抑制 HSC-T6增殖的作用 (F=84.513,P＜0.01),其中 10μmol/L組效果更為明顯 (P＜0.01);培養(yǎng) 72 h后,補(bǔ)骨脂素濃度為 10μmol/L和 1μmol/L組均有抑制 HSCT6增殖的作用 (F=193.892,P＜0.01)。

表1 補(bǔ)骨脂素對(duì) HSC-T6增殖作用的影響 (n=8±s)Table 1 Effect of psoralen on the proliferation of HSC-T6(n=8,±s)

表1 補(bǔ)骨脂素對(duì) HSC-T6增殖作用的影響 (n=8±s)Table 1 Effect of psoralen on the proliferation of HSC-T6(n=8,±s)

注:同空白對(duì)照組比較,＊P＜0.01;同補(bǔ) 1組比較,#P＜0.01。Note:compared with control group,＊P＜0.01;compared with P1 group,#P0.01.

組別Group吸光度Absorbency 24 h 48 h 72 h空白對(duì)照 0.340±0.021 0.442±0.022#0.529±0.021#補(bǔ)1(P1) 0.229±0.020＊0.240±0.022＊0.325±0.015＊補(bǔ)2(P2) 0.318±0.020 0.328±0.021＊#0.369±0.052＊補(bǔ)3(P3) 0.320±0.022 0.331±0.024＊#0.515±0.022#補(bǔ)4(P4) 0.325±0.024 0.356±0.022＊#0.521±0.021#

2.2 補(bǔ)骨脂素對(duì) HSC-T6的 SOD、GSH、MDA、GSHPx的影響 (表 2)

與空白對(duì)照組比較,模型組的 GSH和MDA含量明顯升高,而 SOD和 GSH-Px活性顯著下降 (P＜0.01)。與模型組比較,濃度為 10μmol/L,1μmol/L和 0.1μmol/L補(bǔ)骨脂素治療組能夠不同程度的降低 GSH和 MDA水平,增強(qiáng) SOD和 GSH-Px活力(P＜0.01),呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明 10 μmol/L的補(bǔ)骨脂素能夠使 HSC-T6很好的抵抗由H2O2引起的氧化應(yīng)激。

表2 補(bǔ)骨脂素對(duì) HSC-T6培養(yǎng)上清液中 GSH、MDA、SOD和 GSH-Px含量的影響 (n=8,±s)Table 2 Effect of psoralen on the content of GSH,MDA,SOD,and GSH-Px in the cell culture supernatant(n=8,±s)

表2 補(bǔ)骨脂素對(duì) HSC-T6培養(yǎng)上清液中 GSH、MDA、SOD和 GSH-Px含量的影響 (n=8,±s)Table 2 Effect of psoralen on the content of GSH,MDA,SOD,and GSH-Px in the cell culture supernatant(n=8,±s)

注:同空白對(duì)照組比較,＊P＜0.01;同模型組比較,#P＜0.01。Note:compared with control group,＊P＜0.01;compared withModel group,#P＜0.01.

組別 Group GSH(NU/L) MDA(μmol/L) GSH-Px(KU/L) SOD(μmol/L)空白對(duì)照 Control 34.96±2.48# 0.441±0.025# 72.83±2.35# 27.15±1.811#模型組Model 64.08±3.43＊ 0.933±0.022＊ 24.77±3.28＊ 5.80±1.841＊補(bǔ) 1(P1) 42.02±3.16＊# 0.510±0.033＊# 94.43±2.17＊# 23.61±1.961＊#補(bǔ) 2(P2) 45.07±3.68＊# 0.552±0.026＊# 71.48±2.86＊# 14.27±1.868＊#補(bǔ) 3(P3) 54.40±2.91＊# 0.643±0.031＊# 63.19±1.88＊# 10.74±1.415＊#

2.3 補(bǔ)骨脂素對(duì) HSCs培養(yǎng)上清液中 I型膠原蛋白含量的影響 (表 3)

與空白對(duì)照組比較,模型組的 I型膠原含量明顯升高 (P＜0.01)。與模型組比較,濃度為 10μmo/L,1μmol/L和 0.1μmol/L補(bǔ)骨脂素治療組能夠不同程度的降低 I型膠原含量 (P＜0.01),呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表3 補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞分泌 COL I含量的影響 (n=8,±s)Table 3 The effect of psoralen on the does of COL I in HSC(n=8,±s)

表3 補(bǔ)骨脂素對(duì)肝星狀細(xì)胞分泌 COL I含量的影響 (n=8,±s)Table 3 The effect of psoralen on the does of COL I in HSC(n=8,±s)

注:同空白對(duì)照組比較,＊P＜0.01;同模型組比較,#P＜0.01。Note:compared with control group,＊P＜0.01;compared with model group,#P＜0.01.

組別 Group I型膠原 (ng/mL)空白對(duì)照組 Control 133.38±2.394#模型組Model 184.61±2.600＊補(bǔ) 1(P1) 144.33±2.931＊#補(bǔ) 2(P2) 156.73±2.955＊#

3 討論

研究顯示,雌激素及其代謝產(chǎn)物均能夠有效的抑制 HSC增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)[5],從而具有抗肝纖維化的作用。肝臟中存在雌激素受體,能對(duì)雌激素產(chǎn)生反應(yīng),從而調(diào)節(jié)肝臟的功能[8].黃酮類(lèi)化合物木黃酮[3,6],異黃酮槲皮素[7]均被證明對(duì)肝星狀細(xì)胞的增殖和功能有明顯的抑制作用,具有抗肝纖維化的作用。而對(duì)于香豆素類(lèi)化合物對(duì)肝星狀細(xì)胞的作用及是否具有同樣的抗肝纖維化的作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)植物雌激素香豆素類(lèi)化合物補(bǔ)骨脂素能夠抑制體外培養(yǎng)的 HSC-T6的增殖,并呈量效依賴(lài)性,尤其是在作用 48 h時(shí)效果顯著,提示補(bǔ)骨脂素具有抗肝纖維化作用。

體內(nèi)在氧應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的自由基可以攻擊細(xì)胞膜導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化,使肝細(xì)胞損傷和壞死,通過(guò)一系列的反應(yīng)激活 HSC-T6和其他 ECM產(chǎn)生細(xì)胞 (包括內(nèi)皮細(xì)胞核肝細(xì)胞等),分泌大量的 I型膠原使ECM增多,大量沉積于肝竇間隙,最終導(dǎo)致肝纖維化。由氧自由基引起的氧化應(yīng)激則是導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化的中心環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)用 H2O2與 HSC-T6共培養(yǎng),誘導(dǎo)氧化應(yīng)激是較理想的肝纖維化模型。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終末產(chǎn)物,可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞腫脹,壞死,其含量高低反映體內(nèi)自由基過(guò)氧化的程度。SOD是超氧陰離子自由基的清除劑,可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),是抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的重要酶類(lèi)。GSH與 GSH-Px是一對(duì)相互影響的指標(biāo),GSH為機(jī)體內(nèi)含量最多的含硫基三肽,對(duì)內(nèi)外刺激性代謝產(chǎn)物有解毒作用,主要被 GSH-Px氧化后對(duì)蛋白巰基有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組的 SOD水平下降,MDA含量升高,提示存在明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化。與模型組比較,補(bǔ)骨脂素能顯著降低MDA和 GSH含量,提高 SOD活性和 GSH-Px含量,并能夠明顯降低培養(yǎng)液中 I型膠原水平。

提示補(bǔ)骨脂素之所以能夠抑制 HSC-T6增殖,其機(jī)制可能與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān),但是對(duì)其在體內(nèi)試驗(yàn)是否具有同樣的抗肝纖維化作用需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。另外,由于不同性別的肝細(xì)胞中的雌激素受體數(shù)量及分布有較大的差異,我們推測(cè)補(bǔ)骨脂素有可能是通過(guò)作用于肝細(xì)胞上的雌激素受體而發(fā)揮作用,關(guān)于這一推測(cè),我們?cè)诤罄m(xù)試驗(yàn)中將進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Effects of Psoralen on the Proliferation and Oxidative Stress of Hepatic Stellate Cell(HSC-T6)and the Secretion of Collagen

IGUO Min1,L IDian-gui2＊,WANG Jian-hua3,GAO Shao-fang4,ZHANGWan1,ZHANG Hong-lian1

1HebeiMedical University Post-graduated College,ShijiaZhuang 050017,China;2Traditional ChineseMedicine Hospital Affiliated to HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang 050011,China;3HebeiMedical University,Laborary of Natural Product Che mistry,Shijiazhuang 050017,China;4Shijiazhuang Health School,Shijiazhuang 050017,China

R285.5

A

1001-6880(2011)01-0035-04

2009-06-15 接受日期:2009-09-08

＊通訊作者 Tel:86-15176947679;E-mail:hbguomin@sina.com