膠束電動色譜法分析奶中兩種主要的共軛亞油酸異構體

王臘梅,陳 燕,劉曉華,曹郁生

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室南昌大學中德聯合研究院,南昌 330047

膠束電動色譜法分析奶中兩種主要的共軛亞油酸異構體

王臘梅,陳 燕,劉曉華,曹郁生＊

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室南昌大學中德聯合研究院,南昌 330047

以膠束電動色譜法對奶樣中共軛亞油酸主要的兩種異構體進行了分析。在優化條件下 (80 mM pH 9.0的磷酸鹽緩沖液,54 mM SDS,4%(w/v)β-CD,8M尿素,4%(v/v)乙醇作為運行緩沖液,分離電壓 25 kV,柱溫20℃),膠束電動色譜可在 15 min內對奶樣中兩種主要 CLA,即 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA進行分離測定,最低檢出限為 0.081 ng/mL。分析結果顯示,不同處理奶樣中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),但 CLA的組成相近,其中的 10t,12c-CLA含量差異不顯著P=0.999,約為 3%;不同品種奶樣,如牛奶、水牛奶和羊奶中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),其中 CLA含量次序為牛奶 ＞羊奶 ＞水牛奶,并且不同品種奶的 9c,11t-CLA與 10t,12c-CLA比例差異顯著 (P＜0.05)。

共軛亞油酸;奶;膠束電動色譜法

Abstract:A micellar electrokinetic chromatography method was used to analyze the major conjugated linoleic acid(CLA)isomers in milk.Under the optimized conditions(80 mM borate(pH 9.0),54 mM sodium dodecyl sulphate,4%(w/v)β-cyclodextrin,8 M urea,4%(v/v)ethanol,25 kV and 20℃),the major CLA isomers 9c,11t-CLA and 10t,12c-CLA could be separatedwithin 15 min byMEKC.Limitof detection of thismethod is 0.081 ng/mL.The results indicated that there was a significant difference in the total CLA content among raw milks,pasteurized milk,UHT milk(P＜0.001).However,the content of 10t,12c-CLA from all samples was similar(3%).The result also showed there was a significant difference in the totalCLA content and 10t,12c-CLA content among the cow milk,goatmilk and buffalo milk.

Key words:conjugated linoleic acid;milk;micellar electrokinetic chromatography

共軛亞油酸(CLA)是一類位置和幾何異構體十八碳共軛二烯酸的統稱。天然的 CLA主要存在于反芻動物的奶和肉的脂肪中,含量很低,是一些食物中的天然成分。乳中有兩種重要的共軛亞油酸異構體 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA,已經證明這兩種CLA有著有益的生理活性[1],如 9c,11t-CLA具有抗癌[2,3],抗粥樣動脈硬化[4],免疫調節的功能。而10t,12c-CLA對動物具有減肥和改善機體成分的作用,可以減少脂肪的合成[5,6]。這說明不同異構體有不同的生理活性。建立可靠的分析方法對確定食品中共軛亞油酸異構體組成,研究不同異構體的生理活性及共扼亞油酸產品的研究、開發和生產,都具有十分重要的意義。

目前,常用的分析 CLA的方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、氣質聯用法、傅立葉變換紅外光譜法等。高效液相色譜法存在著分析時間長、試劑消耗量大的缺點,氣相色譜法存在著衍生化過程復雜的缺點,而質譜法和紅外光譜法都不能單獨使用來確定 CLA各種異構體的組成。上世紀八十年代,Terabe等[7]發展的膠束電動色譜 (micellar electrokinetic chromatography,MEKC)做為毛細管電泳技術的一種分離模式,由于其高靈敏度、高分辨率、高效、快速、易自動化、污染小等優點,已迅速的應用于生命科學、食品科學、毒理學、藥物學等領域。

乳是 CLA主要的天然來源,乳中 CLA的含量和組成常常受到季節、動物品種、加工方法、儲存時間等因素的影響,快速準確的檢測很有必要。本研究以膠束電動色譜法對奶樣中兩種主要 CLA異構體進行分析,對檢測的方法、條件以及樣品處理進行了優化,并對幾種奶樣中的 CLA含量組成進行了比較分析。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

十二烷基硫酸鈉、甲醇、硼酸、硼酸鈉、β-環糊精、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、乙醚、石油醚、硫酸鈉、尿素均為國產分析純。

9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA標品 (南昌華興生物科技有限公司)。

1.2 儀器

PA/ECMDQ毛細管電泳系統 (Beckman),熔融石英毛細管 (70 cm×100μm i.d.,Beckman),PB602-E電子精密天平 (Mettler Toledo),PB10 pH計 (賽多利斯),TGL-16B臺式離心機 (上海安亭科學儀器廠),超純水制備器 (Mllipore),RK510S超聲波脫氣機 (Bandelin),旋渦混合器 (上海躍進醫療器械廠),氮吹儀,冰箱,超低溫冰箱。

2 實驗方法

2.1 奶樣來源及取樣

鮮牛奶來自南昌市某奶站;巴氏殺菌牛奶、UHT牛奶購自某超市;羊奶為市售品牌巴氏殺菌羊奶;水牛奶來自廣西水牛研究所。

鮮牛奶和巴氏殺菌牛奶均當日測樣,UHT(保質期分別為 40 d和 6個月)奶為保存 1個月所測樣。各種奶樣分別隨機取 500 mL,作進一步分析。

2.2 奶樣中乳脂的提取

奶樣低溫離心 (10000 r/min,15 min,4℃),取上層固體于三角瓶中,加入正己烷-異丙醇 (v/v,1∶1)混合液,超聲波處理 30 min,取上層,無水Na2SO4過濾干燥 (使用前 110℃烘干 30 min),N2吹去有機試劑,-20℃保存待用。

2.3 乳脂皂化處理[8]

取已提取乳脂,加入 1 M KOH-C2H5OH,60℃水浴 1 h,反應結束后旋轉蒸發除 C2H5OH,加水及乙醚適量 (乙醚除不皂化物),水層以 2 M H2SO4調至 pH=2.0令游離脂肪酸從水層游離,石油醚提游離脂肪酸兩次,以無水 Na2SO4干燥,使用前除去石油醚。

2.4 電解液配制

2.4.1 母液的配制[9]

配制 80 mM的硼酸鹽緩沖液 (配制于超純水中),pH值為 9.0;將 SDS配制于 Borate中,濃度為54 mM。構成母液。

2.4.2 運行緩沖液的配制

將β-CD、尿素、乙醇直接加入母液,構成運行緩沖液。β-CD濃度為 4%(w/v),尿素濃度為 8 M,乙醇濃度為 4%(v/v)。

2.5 膠束電動色譜法分析 CLA條件

每次進樣檢測前,依次用甲醇洗柱 2 min,超純水洗柱 2 min,1 M鹽酸洗柱 5 min,超純水洗柱 2 min,然后再用 1 M氫氧化鈉和超純水分別洗柱 10 min。

紫外檢測波長:233 nm;分離電壓:25 kV;毛細管柱溫:20℃;進樣方式:壓力進樣 0.5 psi.(l psi.=6894.76 Pa),10 s;陽極進樣,陰極檢測。

在每個樣品電泳之間,用 0.1 M氫氧化鈉洗柱2 min、超純水洗柱 1 min、運行緩沖液洗柱 4 min。

2.6 標準曲線的繪制

準確稱取 9c,11t-CLA及 10t,12c-CLA標品,以甲醇溶解 ,分別配制為 2.5、5、29、40、100、200、400、800、1000μg/mL的 9個濃度的標準液 ,按上述色譜條件經過分析,測得其峰面積,以標準溶液濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,對峰面積和進樣量進行一元線性回歸分析。

2.7 最低檢出限

從檢測的最適濃度開始,降低進樣標準品的濃度,直到得到儀器可定量的最低濃度,然后連續進樣20次,計算其平均值,然后除以標準曲線回歸方程的斜率,即為儀器的最低檢出限。

2.8 數據分析及處理

用軟件 SPSS16.0進行方差分析及 t檢驗,顯著性水平取α=0.05。

3 結果與討論

3.1 電泳條件的優化

參考劉曉華等報道的方法[9],對分離電壓、柱溫和進樣時間進行了優化。

3.1.1 進樣時間

固定分離電壓和柱溫,考察進樣時間對分離的影響時發現,盡管進樣時間越短,分離度越好,峰形越好,但峰電流會隨進樣時間而降低,峰的重現性會變差,影響分析的精確度。同時,適當的增加進樣時間,可保證峰的重現性及分析的靈敏度,但分離度會下降。綜合考慮以上,進樣時間選擇為 10 s,通過分離電壓和柱溫的選擇來達到較好的分離分析效果。

3.1.2 分離電壓

分離電壓極大的影響著電滲流和焦耳熱,從而影響分離度。增加電壓會極大的減小出峰時間,達到較短的分析時間,但也會降低分離度。本實驗的分離電壓選擇為 25 kV來改善分離度。

3.1.3 柱溫

隨柱溫的增加,緩沖液粘度降低,電滲的速度加大,出峰時間會顯著降低,分離度也會下降。本實驗的柱溫選擇為 20℃來達到較短的出峰時間。

3.2 標準曲線繪制

取不同濃度的 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA標品進樣,以標準溶液濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,對峰面積和進樣量進行一元線性回歸分析。9c,11t-CLA標準曲線如圖 1所示,y=731.21x+2872.6,R2=0.9977,說明在 2.5～1000 μg/mL范圍內呈良好線性關系,在該濃度范圍內可用于 CLA的定量分析。

10t,12c-CLA標準曲線如圖 2所示,y=727.74x+4655.1,R2=0.9974,說明在 2.5～1000μg/mL范圍內MEKC分析的峰面積同 10t,12c-CLA的進樣濃度呈良好線性關系,可在該濃度范圍內用于 CLA的定量分析。

圖1 9c,11t-CLA標準曲線Fig.1 The standard curve of 9c,11t-CLA

圖2 10t,12c-CLA標準曲線Fig.2 The standard curve of 10t,12c-CLA

3.3 方法精密度

取 9c,11t-CLA標品,以甲醇溶解,制備不同濃度的溶液,在 233 nm下測定,重復進樣 3次,得出峰面積和保留時間的相對標準偏差 (RSD),結果如表所示。

表1 MEKC法分析 9c,11t-CLA的相對標準偏差Table 1 Relative standard deviation of 9c,11t-CLA deter mined byMEKC

由表可以看出,峰面積的相對標準偏差為1.459%～3.205%,保留時間的相對標準偏差為0.962%～1.822%。

3.4 方法回收率

取不同奶樣進行乳脂提取,并經過皂化處理,分別加 9c,11t-CLA標品,在 233 nm下測定,重復進樣5次,計算回收率,結果如表所示。

表2 MEKC法分析 9c,11t-CLA的回收率Table 2 Recovery rate of CLA determined byMEKC

2 100.530 100 200.405 99.875 3 203.724 100 307.968 104.244 4 283.639 200 483.113 99.737 5 318.943 200 509.823 95.440

由表可以看出,回收率為 95.440%～104.595%,RSD為 3.745%。

3.5 最低檢出限

取 9c,11t-CLA標品稀釋,進行MEKC分析。在響應值為基線噪音三倍時 (S/n=3),在 233 nm下測定,重復進樣 20次,平均值為 59.49 ng/mL,根據下式計算最低檢出限:

最低檢出限 =s/b=59.49/731.21=0.081 ng/mL

經計算,該方法的最低檢測限為 0.081 ng/mL,可用于低濃度樣品的分析測定。

3.6 MEKC對共軛亞油酸兩種異構體標品的分離

取 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA標品配為混合標品,在優化條件下以 MEKC分析,兩種異構體可以得到有效分離,其出峰時間分別是:10t,12c-CLA為 10.5分;9c,11t-CLA為 11.0分 (圖 3),分析時間不足 15 min,可用于大批量樣品的 CLA分析測定。

圖3 優化條件下MEKC分離 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA標品Fig.3 Chromatogram of the mixture of 9c,11t-CLA and10t,12c-CLA

3.7 MEKC法測定奶樣中的 CLA

取不同奶樣提取乳脂,經皂化處理,在優化條件下用MEKC進行分析。從圖 4可見共軛亞油酸最大吸收波長為 233 nm。

圖4 MEKC分析奶樣的最大吸收波長Fig.4 Chromatogram of samples

對奶樣中 CLA進行分析的MEKC圖如圖 5所示,根據標品的出峰時間判斷該奶樣中含有 9c,11t-CLA和 10t,12c-CLA。

圖5 奶樣中 CLA的MEKC分析圖譜Fig.5 Chromatogram of samples analyzed byMEKC

在優化條件下對鮮奶、巴氏奶、UHT奶中的CLA異構體進行分析測定,結果如表 3所示。鮮奶、巴氏奶和 UHT奶中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),其 CLA含量次序為鮮奶 ＞巴氏奶 ＞UHT奶;但 CLA的組成相近,其中的 10t,12c-CLA含量差異不顯著 (P=0.999),約為 3%。

表3 MEKC法對不同處理奶樣中 CLA異構體的含量測定 (n=7)Table 3 CLA contents of different samples deter mined byMEKC(n=7)

在優化條件下對牛奶、水牛奶、羊奶中的 CLA含量進行分析測定,結果如表 4所示,牛奶、水牛奶、羊奶中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),其中水牛奶的 CLA含量僅為 2.972 mg/g乳脂,但是,各奶樣中的乳脂率不同,有報道,每 100 mL水牛乳中可含有高達 8 g的脂肪,而羊奶和牛奶中這一數值僅為 3 g左右。并且,牛奶、水牛奶、羊奶中的 9c,11t-CLA與 10t,12c-CLA比例差異顯著 (P＜0.05),羊奶中 10t,12c-CLA含量較高為 3.189%,而牛奶中的10t,12c-CLA含量僅為 2.388%。

表4 MEKC法對不同品種的奶樣中 CLA異構體的含量測定 (n=7)Table 4 CLA content of different an imalmilk samples determined byMEKC(n=7)

4 結論

對MEKC的分離條件進行了優化,最佳條件為:分離電壓 25 kV,柱溫 20℃,進樣時間 10 s。在優化的條件下,MEKC可對奶樣中的 9c,11t-CLA與10t,12c-CLA進行較好的分離,出峰時間:10t,12c-CLA為 10.5分;9c,11t-CLA為 11.0分,分析時間不到 15 min,適合大批量樣品的快速分析。峰面積的相對標準偏差為 1.459%～3.205%,保留時間的相對標準偏差為 0.962%～1.822%,回收率為98.105%～103.054%,說明該方法的精密度和準確度均較好。因此 MEKC法可用于奶樣中 9c,11t-CLA 10t,12c-CLA兩種主要異構體的分析測定,且該法的最低檢出限為 ng級,更適合低濃度樣品的分析。

以MEKC法對不同熱處理奶中的 CLA異構體進行分析,結果顯示鮮奶、巴氏奶中的 CLA含量較高,與 UHT奶差異顯著 (P＜0.001)。鮮奶中的CLA總含量高達 9.288 mg/g乳脂,巴氏奶略低,其CLA總含量為 9.129 mg/g乳脂,而 UHT奶中的CLA總含量最低,保質期 40 d和 6個月的 UHT中總 CLA含量分別為 8.631 mg/g乳脂和 8.613 mg/g乳脂。各奶樣的 CLA組成相近,10t,12c-CLA含量差異不顯著P=0.999,約為 3%。以MEKC法對不同品種奶樣中的 CLA進行分析,結果顯示不同品種奶,如檢測的牛奶、水牛奶、羊奶中的 CLA含量差異顯著 (P＜0.001),其 CLA含量分別為:牛奶樣為9.220 mg/g乳脂,水牛奶樣為 2.972 mg/g乳脂,羊奶樣為 6.054 mg/g乳脂,且 9c,11t-CLA與 10t,12c-CLA的含量和比例差異顯著 (P＜0.05)。

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Separation of Conjugated Linoleic Acid Isomers in Milk by Micellar Electrokinetic Chromatography

WANGLa-mei,CHEN Yan,L IU Xiao-hua,CAO Yu-sheng＊
State Key Laboratory of Food Science and Technology,Sino-Ger man Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China

TS252.1;TS225.2

A

1001-6880(2011)01-0015-05

2010-04-02 接受日期:2010-10-14

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