一株嗜鹽菌新種的分離與鑒定

白雪冬,吳 敏,李遂焰

1西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,成都 610031;2浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310058

一株嗜鹽菌新種的分離與鑒定

白雪冬1,2,吳 敏2,李遂焰1＊

1西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,成都 610031;2浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310058

從舟山冊子島船舶壓載水泥樣中分離到一株細(xì)菌 S3-22,其與已知細(xì)菌的 16S rDNA序列相似性低于97%,G+C mol%為 54.9 mol%,主要脂肪酸 iso-C17:1ω9c(24.99%),細(xì)胞醌型為甲基萘醌 MK-5。革蘭氏染色陰性,最適生長條件為 30～37℃、pH 7、3%NaCl。嗜鹽,氧化酶、接觸酶、淀粉酶、酯酶呈陽性,可還原硝酸鹽。依據(jù)其 16S rDNA序列相似性、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析及細(xì)胞與分子水平的鑒定表明,該菌是Kordii monas屬的一個新種,菌株 S3-22的 16S rDNA序列登陸號為 FJ847942。

嗜鹽菌;新種;鑒定

Abstract:A marine bacterium,designated strain S3-22,was isolated from the ballastwater sample from Zhoushan archipelago,China.16S rDNA sequences similarity of strain S3-22 to all recognized bacterial species was not greater than 97%.The DNA G+C contentwas 54.9 mol%.The dominant fatty acid was iso-C17:1ω9c(24.99%).The major respiratory quinine wasMK-5.Cells of strain S3-22 were gram-negative.Optimal growth of strain S3-22 was at pH 7.0,30–37℃and 3%(w/v)NaCl.Itwas halophilic and tested positive for catalase,oxidase,amylase,and esterase.In addition,it could deoxidize the nitrate.Based on the evidence of 16S r DNA sequences similarities,phylogenetic analysis and cellular and molecular level identification,the halophile formed a phyletic lineage which was distinct from the knownKordiim onasspecies.Strain S3-22 represented a novel species in theKordiim onas,its Genebank Accession number was FJ847942.

Key words:halophile;novel;identification

海洋中的微生物種類豐富,基因組成和生物學(xué)功能具有多樣性,使微生物能夠適應(yīng)海洋高鹽、高壓、低溫、低營養(yǎng)和無光照等特殊區(qū)域生態(tài)環(huán)境。開展海洋微生物多樣性的研究,對于豐富海洋生物基因資源庫、開發(fā)海洋生物活性物質(zhì)、保護(hù)和修復(fù)海洋生態(tài)環(huán)境等具有極其重要的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

樣品采自舟山冊子島 7萬噸船舶壓載水,半流動性泥樣,含水率 44.3%,取樣后 4℃保存。對照菌株為Kordiim onas gwangyangensisJCM 12864T,購自日本微生物保藏中心(Japan Collection ofMicroorganis ms,JCM)。

1.2 菌株的分離和培養(yǎng)

適量樣品用含 Tween80(0.1%)的 Marine Broth2216(MB)培養(yǎng)基懸浮,30℃震蕩 2～3 h,取上清涂布平板Marine Agar2216(MA),30℃培養(yǎng) 3 d,反復(fù)劃線純化獲得單菌落。純化后的菌株于 30%(v/v)甘油,– 80℃冰箱中保存。

1.3 16S rDNA序列的克隆及測序

1.3.1 基因組 DNA的提取

采用苯酚氯仿法[1]抽提基因組 DNA。獲得的基因組DNA于– 20℃保存。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

使用細(xì)菌 16S rDNA通用引物 B1、B4,PCR程序為:95℃預(yù)變性 5 min,94℃變性 30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 75 s,33個循環(huán),72℃延伸 10 min,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單側(cè)測序。測定的序列采用 Blastn和EzTaxon server 2.1[2]進(jìn)行比對。單側(cè)相似性低于97%的序列兩端測序。序列拼接后長度大于 1300 bp,相似度仍低于 97%,定義為疑似新種。樣品經(jīng)過初步篩選,獲得一個疑似新種,編號為 S3-22。

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及序列測定

菌株 S3-22的 PCR產(chǎn)物采用直接 TA克隆法[3]進(jìn)行克隆。重組質(zhì)粒測序結(jié)果通過拼接,獲得菌株S3-22的 16S r DNA序列。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株 S3-22的 16S rDNA序列與從 GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的 16S r DNA序列利用 Blastn和 EzT-axon server2.1比對,采用 Clustal軟件包進(jìn)行多序列匹配排列,通過 MEGA 4.1[4]軟件包,采用 Neighborjoining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 表型特征的觀察

觀察菌株 S3-22的菌落在培養(yǎng)基上的形狀、大小、顏色、粘稠度、透明度、邊緣和隆起情況,細(xì)胞革蘭氏染色[3]等,記錄結(jié)果。

1.6 G+C mol%含量的測定

提純的DNA沸水浴中熱變性,P1核酸酶 (340 U/mL)處理 DNA長鏈,37℃作用 2 h。小牛小腸堿性磷酸酶處理 6 h,pH 7.5-8.5,37℃。直接采用HPLC方法測定[5]。

色譜柱:ODS-AQ,Hydrosphere C18反相柱,4.6×250 mm;pH范圍 2～7;流動相:12%甲醇,20 mmol/L三乙胺,磷酸調(diào)整 pH為 5.1。上樣量 15 μL。色譜條件:流速 10 mL/min,柱溫 37℃;檢測波長 210 nm。標(biāo)準(zhǔn) DNA:Salmon sper m DNA,(G+C)mol%=41.2%。

1.7 醌的測定

標(biāo)準(zhǔn)菌株Kordiim onas gwangyangensis[6]作為對照,甲醇∶氯仿 (1∶2,v/v)抽提凍干細(xì)胞,以正己烷∶乙醚 (34∶6,v/v)做層展劑,用 Vk做標(biāo)準(zhǔn)。展層后硅膠板在紫外燈下觀察 (波長 245 nm),在綠色熒光背景下呈現(xiàn)褐色的條帶即為甲基醌的位置。刮下條帶,用氯仿溶解,收集上清,進(jìn)行 HPLC分析。

層析柱:十八烷基硅烷;流動相:乙腈∶異丙醇 2∶12(v/v);流速:1 mL/min;柱溫:40 ℃;柱壓:90-100 kpa;檢測:270 nm。

1.8 脂肪酸的測定

取一定量菌體置于無菌厭氧玻璃管中,逐一加入溶液Ⅰ(14.4 g氫氧化鈉溶于 150 mL甲醇及 150 mL蒸餾水)、溶液Ⅱ(190 mL濃鹽酸,275 mL甲醇溶于 135 mL蒸餾水)、溶液Ⅲ(200 mL正己烷與200 mL甲基叔定基醚混合均勻)、溶液Ⅳ(10.8 g氫氧化鈉溶于 900 mL蒸餾水)處理。收集上層有機(jī)相,用 N2吹干。少量正己烷溶解,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析樣品[7]。

1.9 最適生長條件的測定

1.9.1 NaCl濃度影響

NaCl濃度范圍 0%～20%(w/v),MB培養(yǎng)基,1%接種量,35℃培養(yǎng)。

1.9.2 pH影響

酸堿度范圍 pH5-10,MB培養(yǎng)基,1%接種量,35℃培養(yǎng)。

1.9.3 溫度影響

培養(yǎng)溫度范圍 4～48℃,MB培養(yǎng)基,1%接種量。

菌株 S3-22生長約 20 h至穩(wěn)定期,測定 OD590吸光度,獲得最適生長條件,繪制生長曲線。

1.10 生理生化特性研究

包括酶學(xué)、硝酸鹽還原、產(chǎn)硫化氫、碳源利用等。采用 API20NE、APIZY M、API50CH和 API32GN鑒定系統(tǒng)進(jìn)行測定[5-7]。

2 實驗結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)特征觀察

菌株 S3-22接種于MB培養(yǎng)基 3 d后有明顯菌落,菌落直徑 1～2 mm,規(guī)則圓形,隆起,透明,鵝黃色,表面光滑濕潤。電子顯微鏡觀察菌體形態(tài),為桿狀,無鞭毛。

2.2 16S r DNA序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過 TA克隆獲得菌株 S3-22的 16S rDNA序列為 1419 bp,該序列已經(jīng)提交到 GeneBank數(shù)據(jù)庫,序列號 FJ847942。根據(jù)獲取菌株 16S rDNA序列并進(jìn)行比對之后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,可以看出菌株 S3-22與標(biāo)準(zhǔn)菌株Kordii monas gwangyangensis位于同一個分支上,進(jìn)化距離最近,因此親緣關(guān)系最近。TA克隆產(chǎn)物見圖 2,系統(tǒng)發(fā)育樹見圖 3。

2.3 最適生長條件的測定

最適生長條件曲線見圖 4～圖 6。

2.4 主要特性分析

對菌株 S3-22和標(biāo)準(zhǔn)菌株Kordi imonas gwangyangensis的生長條件、革蘭氏染色、酶學(xué)、硝酸鹽還原、G+C摩爾含量、細(xì)胞醌型和脂肪酸的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,具體實驗結(jié)果見表 1。

表1 菌株 S3-22與K.gwangyangensis特性比較Table 1 Characteristic differences be tween strain S3-22 andK.gwangyangensis

2.5 碳源利用結(jié)果

采用API鑒定系統(tǒng)進(jìn)行測定,結(jié)果表明菌株S3-22可以利用葡萄糖、海藻糖、纖維二糖、麥芽糖、谷氨酸、天冬氨酸、纈氨酸、精氨酸、酪氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸、鳥氨酸、乙酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸等做為唯一碳源。

3 討論

根據(jù) 16S rDNA序列相似性、系統(tǒng)發(fā)育分析、分子水平鑒定以及生理生化特性研究,判斷菌株 S3-22為Kordiim onas屬下的一個新成員,代表一個新的分類單元。Kordi imonas屬目前只有一個有效種K.gwangyangensis。菌株 S3-22的 NaCl生長濃度為0.5%～7.5%,最適濃度 3%,輕度嗜鹽,屬于弱嗜鹽菌。菌株 S3-22具有產(chǎn)生淀粉酶,明膠酶,酯酶,酪氨酸酶等活性物質(zhì)的能力。由于菌株 K.gwangyangensis具有降解高分子芳香族化合物的特性,推測菌株 S3-22也具有相似特性,其性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。

目前對海洋嗜鹽菌的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,雖然已有一些酶類從嗜鹽菌中分離出來并進(jìn)行了性質(zhì)研究,但尚不能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求。在海洋生物資源探索備受矚目的情況下,必定會有更多具有價值的海洋微生物被分離,獲得更多的活性物質(zhì)。對這些海洋微生物以及活性物質(zhì)進(jìn)行深入研究,無疑具有重要的研究意義和應(yīng)用前景。

1 Xu XH(徐曉紅 ),Wu M(吳敏 ),Cao Y(曹軼 ),et al.Isolation and phylogenetic analysis of halophilic archaea AJ6.J Zhejiang Univ,Sci Ed,2005,32(1):83-88.

2 Chun J,Lee JH,Jung Y,et al.EzTaxon:a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomalRNA gene sequences.Int J Syst Evol M icrobiol,2007,57:2259-2261.

3 Shen P(沈萍).Microbiology(微生物學(xué)).Beijing:Higher Education Press,2000.267-272.

4 Kumar S,NeiM,Dudley J,et al.MEGA:a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences.B rief B ioinfo rm,2008,9:299-306.

5 Schleheck D,Tindall BJ,Rossello MR,et al.Parvibaculu mlavamenti voransgen.nov.,sp.nov.,a novel heterotroph that initiates catabolism of linear alkylbenzenesulfonate.Int J Syst EvolMicrobiol,2004,54:1489-1497.

6 Kwon KK,Lee HS,Yang SH,et al.Kordiim onas gwangyangensisgen.nov.,sp.Nov.,a marine bacterium isolated from marine sediments that fo rms a distinct phyletic lineage(Kordiim onadalesord.nov.)in the’Alphaproteobacteria.’Int J Syst EvolM icrobiol,2005,55:2033-2037.

7 Kurahashi M,Fukunaga Y,Harayama S,et al.Sneathiella glossodoripedissp.Nov.,a marine alphaproteobacterium isolated from the nudibranch Glossodoris cincta,and proposal ofSneathiellalesord.nov.andSneathiellaceaefam.Nov.Int J Syst EvolM icrobiol,2008,58:548-552.

Seperation and I dentifi cation of a Novel Halophile

BA IXue-dong1,2,WU Min2,L I Sui-yan1＊

1College of Life Science and Engineering,Southwest Jiaotong University,Chengdu 610031,China;2College of Life Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China

Q939

A

1001-6880(2011)01-0006-04

2009-11-23 接受日期:2010-03-30

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃資助項目(973計劃)

＊通訊作者 Tel:86-28-87600965;E-mail:suiyanli_@163.com