豬 K88 、K99 、987P、F41 埃希氏大腸桿菌高密度發酵培養技術的初步探討

巫月生,齊冬梅,張毓金,賴月輝,李嘉愛,王卓明

(廣東永順生物制藥有限公司,廣州蘿崗 511356)

仔豬大腸桿菌性腹瀉是由產腸毒素埃希氏大腸桿菌(ETEC)引起的哺乳仔豬急性腸道傳染病,新生仔豬 ETEC的 4個重要的黏附素是 F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和 F41[1],其是引起初生仔豬腹瀉(即仔豬黃痢)的關鍵因素[2],臨床表現為仔豬出生后 1～3 d感染,引起劇烈腹瀉而迅速死亡,死亡率高達 100%。本病對初建種豬場的初產母豬的仔豬危害較大,多年來,國內有關研究單位已開發了單價滅活苗,二價基因工程苗,三價菌毛滅活苗及多價滅活菌苗[3-4],但都存在使用覆蓋面窄或免疫原性差,效價不穩定等問題。疫苗效價很大程度上取決于疫苗中有效抗原的量,菌毛抗原是致病性大腸桿菌主要抗原成分,已知菌毛抗原表達除與菌株、培養基等有關[5]外,培養方法亦至關重要,本研究選擇含 K88、K99、987P、F41的四株豬埃希氏大腸桿菌,采用高密度發酵培養方法表達菌毛抗原取得了較好效果,為制備高效疫苗打下基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬埃希氏大腸桿菌 C83549(K88)、C83644(K99)、C83710(987P)、C83707(F41)四株菌均由廣東永順生物制藥有限公司研發部保存、提供。

1.2 血清 K88、K99、987P、F41標準血清,購自中國獸醫藥品監察所。兔抗 K88、K99、987P、F41四株菌毛抗原血清均由廣東永順生物制藥有限公司研發部制備并保存。

1.3 培養基及其他試劑 普通瓊脂、改良 Minca瓊脂、改良 Minca湯、葡萄糖液、2M氨水、2M HCl等,均按常規方法配制。

1.4 抗體致敏綿羊紅血球 參照《實用免疫學》[6]間接血凝試驗方法制備。

1.5 試驗用主要設備、儀器 BIOSTATR○C22型全自動生物發酵罐,容積 22 L,購自德國貝朗B.Braun公司；紫外 -可見光光度計(Ultrospe 3300pro),購自 Amersham Pharmacia Biotech公司；pHS-3C數字式 pH計,購自上海雷磁儀器廠。

1.6 種子的制備 將各株菌種分別接種在改良Minca瓊脂平板上,37℃培養 18 h,選取灰蘭色、半透明、圓整、凸起、濕潤和邊緣整齊的典型菌落,做平板凝集,應達到 ++++(判定方法參照《中華人民共和國獸用生物制品質量標準》[7]凝集反應強度標準),并再接種到改良 Minca瓊脂扁瓶,37℃培養18 h,用改良 Minca湯洗下,做平板凝集,達到 ++++,經純檢合格后作基本種子液。

1.7 菌液培養

1.7.1 高密度發酵培養 將占高密度發酵罐 2/3至 3/4容積的改良 Minca湯及適量的消泡劑加入罐體中,116℃消毒 30 min。消毒完畢后待罐內培養基溫度降為 37℃時,保持 12～24 h進行無菌檢驗。無菌檢驗合格后接入種子液,在培養過程中,通過高密度發酵罐自動補入葡萄糖液,用 2 mol/L氨水與 2mol/LHCl調節酸堿度,使其保持適宜的pH值和細菌快速分裂生長繁殖所需的營養成分,培養時溫度始終維持在 37℃,并控制一定通氣量和攪拌速度。

1.7.2 普通深層通氣培養[8]培養基及其裝量、種子液、pH值等與前面 1.7.1相同,對 K88、K99、987P、F41四株菌采用傳統普通 20 L玻璃瓶深層通氣培養,在培養過程中,只通入相同的氣量,溫度始終維持在 37℃。

1.8 培養液檢測 規定接種后開始培養時的時間為 0 h,以后每隔 1 h取樣一次,所取的樣品分別用紫外 -可見光光度計(Ultrospe 3300pro)測 OD值(λ=525 nm)；用 pHS-3C數字式 pH計測 pH值。培養結束時,并用傾注平板培養法[9]測活菌數和用96孔板做反向間接血凝試驗(RIHA)[6]測效價。而對于普通深層通氣培養,只在其培養結束時測定活菌數和效價。

2 結 果

2.1 四株菌培養不同時間各參數測定結果 K88、K99、987P、F41四株菌采用兩種不同培養方法培養,測得其培養液在不同時間的活菌數、OD值、pH值、效價,如表 1所示。

2.2 四株菌高密度發酵培養生長曲線的測定結果以菌液的 OD值為縱坐標,以生長時間為橫坐標,描繪出高密度發酵培養菌液的 OD值與時間的關系曲線,如圖 1所示。

表 1 四株菌培養不同時間的活菌數、OD值、pH值、RIHA效價測定的結果

圖 1 四株菌高密度發酵培養菌液的OD值與時間的關系曲線

2.3 高密度發酵與普通深層通氣培養比較試驗結果 K88、K99、987P、F41四株菌采用高密度發酵與普通深層通氣兩種方法培養結束時,所需時間及培養液的活菌數與效價,如表 2所示。

表 2 四株菌用不同方法培養結束時間、菌液的活菌數及效價比較

3 討 論

3.1 一般細菌發酵培養,隨著培養時間延長,反映細菌濃度的 OD值增高,細菌代謝產物也相應增多,其 pH值發生變化的同時抑制細菌本身增殖。高密度發酵培養能自動調節罐內的營養成分及酸堿度,盡管隨著營養成分消耗及代謝產物增加,其pH值基本穩定在 7.0～7.2,這樣就可使細菌處于適宜的環境中快速分裂生長,呈對數生長的菌數大幅度增加,在短時間(7～8 h)內就可達到細菌生長繁殖的高峰期,病原菌在此時,其致病力最強[10],抗原表達量亦較高。

3.2 高密度發酵培養 7～8 h,活菌數為 4.1×1010～4.9×1010CFU/m L,效價高達 211～213；而采用普通深層通氣培養 13～14 h,活菌數為 0.51×1010～0.59×1010CFU/m L,效價為 24～25。說明無論是活菌數或是抗原表達量(即效價),前者培養方法都遠優于后者。所以采用高密度發酵培養技術不但減少培養時間,而且能很好地增加單位抗原量,便于大批量生產。

3.3 本試驗高密度發酵培養結果是根據 K88、K99、987P、F41四菌株培養至 7～8 h或 6～7 h菌液的 OD值變化不大時進行收獲的,培養更長時間未作試驗,效價是否會隨著培養時間的延長還會提高,有待進一步探討。

3.4 四菌株培養至結束時,OD值均比較穩定,此時細菌活菌數亦高,培養中當 OD值達到穩定值時,可能就是細菌生長高峰期。因此,細菌培養過程中,可否以測定 OD值在其穩定時段作為依據來確定終止培養,此外,用不同 OD值表示抗原量與對動物免疫反應等的相關問題還有待進一步研究。

[1] Barbara EStraw,Jeffery JZimmerman,Sylvie D,Allaire,等.豬病學[M].趙德明,張仲秋,沈建忠,譯.第 9版.北京：中國農業大學出版社,2008：724.

[2] 雷夢珍,郭湘霞.仔豬大腸桿菌性腹瀉 K88,K99,987P三價滅活苗的免疫效果[J].中國獸醫雜志,1995,29(2)：6.

[3] 戴鼎震,李 鵬,周長鋒,等.仔豬黃痢K88-K99-987P-F41多價菌毛混合油乳劑滅活疫苗的制備及小鼠免疫保護試驗[J].江蘇農業科學,2003,(1)：55.

[4] 孫 宇,沈玉春.仔豬大腸桿菌 K88-ST1-LTB三價基因工程滅活疫苗的應用實驗[J].中國獸藥雜志,2002,36(9)：35-36.

[5] 陳 雷,成大榮,徐建生,等.大腸桿菌 F1菌毛表達條件的初探[J].中國獸藥雜志,2000,34(10)：10-13.

[6] 楊正彬、伊學念.實用免疫學[M].吉林：長春出版社,1994：403-406.

[7] 中華人民共和國農業部.中華人民共和國獸用生物制品質量標準二○○一年版[S].

[8] 巫月生,吳文福,李嘉愛,等.豬大腸桿菌(K88)菌株的生長規律的探討[J].廣東畜牧獸醫,2001,(5)：29-31.

[9] 王明俊.獸醫生物制品學[M].北京：中國農業出版社,1996：296.

[10]陸承平.獸醫微生物學[M].第三版.北京：中國農業出版社,2001：27.