牛γ干擾素的表達及其抗病毒活性測定

徐正中，陳祥，單鋒麗，孟闖，孫林，黃金林，潘志明，耿士忠，焦新安

揚州大學 江蘇省人獸共患病學重點實驗室，揚州 225009

牛γ干擾素的表達及其抗病毒活性測定

徐正中*，陳祥*，單鋒麗，孟闖，孫林，黃金林，潘志明，耿士忠，焦新安

揚州大學 江蘇省人獸共患病學重點實驗室，揚州 225009

通過RT-PCR從經ConA刺激誘導的奶牛脾臟淋巴細胞總RNA中擴增出牛γ干擾素 (BoIFN-γ) cDNA，克隆到真核載體 pVAX1中，測序結果顯示 pVAX1中的插入序列 BoIFN-γ基因與已報道序列一致。用重組質粒pVAX1-BoIFN-γ轉染COS-7細胞并進行間接免疫熒光試驗鑒定，結果顯示BoIFN-γ在COS-7細胞中得到成功表達。將BoIFN-γ基因克隆到原核表達質粒pET-30a(+)、pGEX-6p-1后，分別轉化重組表達菌BL21(DE3)、BL21后，通過對表達條件的優化，SDS-PAGE分析表明兩種重組蛋白均可實現可溶性表達，大小分別為23 kDa和43 kDa。將含信號肽BoIFN-γ基因克隆到轉座載體 pFastBacTM1中并轉化 DH10Bac，通過位點特異性轉座將 BoIFN-γ基因整合到穿梭載體Bacmid中并通過脂質體轉染Sf9昆蟲細胞，產生重組桿狀病毒rBac-BoIFN-γ，重組病毒傳代擴增感染Sf9細胞后，通過間接免疫熒光試驗證實 BoIFN-γ在桿狀病毒系統中獲得表達。使用 MDBK/VSV細胞系統測定 rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ以及 rBac-BoIFN-γ的抗病毒活性，其效價分別達到 8.389×107U/mg、6.554×105U/mg、4.096×104U/mL，3種具有較高的抗病毒活性重組牛γ干擾素的獲得為其開發應用提供了重要的生物材料。同時使用單克隆抗體5G4和3E6，建立了BoIFN-γ的雙抗夾心ELISA檢測方法并繪制了標準曲線，可定量分析BoIFN-γ的抗病毒活性，為其臨床應用及相關研究提供了重要的方法。

牛γ干擾素，大腸桿菌系統，桿狀病毒系統，抗病毒活性，ELISA

Abstract:Bovine interferon-γ (BoIFN-γ) gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) from total RNA of bovine spleen lymphocytes stimulated with ConA. The products of RT-PCR were cloned into pVAX1 vector, positive recombinant clone was identified by restriction enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid pVAX1-BoIFN-γ was transfected into COS-7 cells mediated by lipofectine, indirect immunofluorescent assay analysis confirmed that rBoIFN-γ wasexpressed in COS-7 cells. BoIFN-γ gene (without signal peptide) was cloned into pET-30a(+) and pGEX-6p-1 vector, and transformed into the Escherichia coli cells. After optimizing the induction condition, SDS-PAGE analysis showed that the expression products were all found in soluble form and had a molecular weight of 23 kDa and 43 kDa respectively. BoIFN-γ precursor gene(with signal peptide) was cloned into transfer vector pFastBacTM1, and transformated into DH10Bac E. coli cells. By site-specific transposition, BoIFN-γ gene was integrated into shuttle vector Bacmid, and transfected into the Sf9 insect cells mediated by lipofectine to produce recombinant baculovirus. Indirect immunofluorescent assay analysis confirmed that rBac-BoIFN-γ was expressed successfully in Baculovirus vector system. The antiviral activities of rHis-BoIFN-γ, rGST-BoIFN-γ and rBac-BoIFN-γ were up to 8.389×107U/mg, 6.554×105U/mg and 4.096×104U/mL respectively, which were analyzed in MDBK/VSV system. A sandwich ELISA was established using monoclonal antibodies 3E6 and 5G4, which can detect BoIFN-γ in quantity and provide a useful method for the clinical practice and research of BoIFN-γ.

Keywords:bovine interferon-γ, Escherichia coli, baculovirus vector system, antiviral activity, ELISA

γ干擾素 (IFN-γ) 主要是由有絲分裂原或特異性抗原刺激而活化的CD4+Th1細胞、CD8+T細胞及 NK細胞等產生的細胞因子，具有廣泛抗病毒、抗腫瘤活性以及免疫調節功能，如活化巨噬細胞、提高 MHCⅠ類和Ⅱ類分子的表達、促進抗原提呈等，是機體防御系統的重要組成部分[1]。研究表明外源性的 IFN-γ既可以作為藥劑用于感染性疾病或腫瘤等的治療，又可以作為免疫佐劑，增強疫苗的免疫效果，還能與一些病原微生物的保護性抗原基因共表達，從而加強和改善疫苗的免疫效果；內源性 IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映機體的細胞免疫狀態，而抗原特異性的 IFN-γ反應則可以作為機體針對某種特定外來抗原的細胞免疫狀態的指標。

利用傳統的方法從牛血液中提取和純化BoIFN-γ，過程繁瑣且含量很低，無法滿足實際使用的需求。1986年，自Cerretti等[2]克隆出牛IFN-γ基因后，利用基因工程技術生產重組牛 IFN-γ(rBoIFN-γ) 用于奶牛疾病的防治研究開始興起，國內外學者已先后利用大腸桿菌[3]、酵母[4]、牛Ⅰ型皰疹病毒 (BHV-1)[5]、桿狀病毒等系統[6]表達出重組牛IFN-γ，并對其免疫學和生物學活性進行了研究。但是目前常用的大腸桿菌系統表達的 BoIFN-γ蛋白多以包涵體形式存在，不能進行翻譯后修飾等過程，因此其空間結構及生物活性與天然抗原有較大差別，另外內毒素也難以去除，因此在臨床應用中受到一定程度的限制。干擾素生物學活性定量分析的研究從干擾素被發現以來就一直沒有間斷過。抗病毒分析方法 (Antiviral assay，AVA) 是第一個建立起來的檢測IFN樣品相對活性或效能的生物學方法。現有的干擾素生物學活性鑒定與定量分析方法普遍存在費時、繁瑣、不夠精確、特異性差等一系列缺陷，亟待改進。

本研究以伴刀豆蛋白 (ConA) 刺激誘導的奶牛脾臟淋巴細胞總 RNA為模板，通過 RT-PCR獲得BoIFN-γ基因cDNA，并將其分別克隆至原核和真核表達載體，以實現重組 BoIFN-γ蛋白的高效可溶性表達。同時使用針對 BoIFN-γ的單克隆抗體[7]建立抗原特異性的雙抗夾心ELISA方法，用于定量分析BoIFN-γ的抗病毒活性，為 BoIFN-γ的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、宿主細菌、細胞及病毒

質粒載體pGEX-6p-1購自Amersham Biosciences公司；pET-30a(+) 購自Novagen公司；pFastBacTM1購自 GIBCO 公司；大腸桿菌 DH5α、BL21、BL21(DE3) 菌株由本實驗室保存；轉座用大腸桿菌DH10Bac (含桿狀病毒穿梭質粒Bacmid和輔助質粒Helper) 購自Invitrogen公司；草地貪夜蛾卵巢細胞系9 (Sf9細胞)、牛腎細胞系 (MDBK)、野生型桿狀病毒 (wtAcNPV)、水泡性口炎病毒 (VSV) 由本室保存。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養基、昆蟲細胞培養基Sf900Ⅱ購自GIBCO公司；FITC標記的羊抗鼠IgG、伴刀豆蛋白 A (ConA) 購自 Sigma公司；胎牛血清購自Hyclone公司；淋巴細胞分離液購自杭州灝洋生物工程公司；脂質體轉染試劑購自Invitrogen公司；高保真DNA聚合酶、限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、DNA回收試劑盒等購自 TaKaRa公司；抗BoIFN-γ高免血清、抗 BoIFN-γ單克隆抗體 (5G4和3E6) 由本室制備保存；其他常規試劑為國產分析純試劑。

1.3 BoIFN-γ cDNA片段的克隆與鑒定

參照BoIFN-γ cDNA序列 (GenBank Accession No. M29867) 設計擴增PreBoIFN-γ cDNA的引物：(下劃線部分為 BamHⅠ酶切位點)，Pa1：5′-GTACTCGA(下劃線部分為 XhoⅠ酶切位點)，預計擴增片段長度為539 bp，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。按常規方法進行牛脾臟淋巴細胞的分離、刺激培養及總RNA的提取，兩步法RT-PCR擴增BoIFN-γ cDNA基因。

1.4 重組質粒pVAX1-PreBoIFN-γ的構建及鑒定

將純化回收的RT-PCR產物經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，克隆入真核表達質粒pVAX1的相應位點之間，參照文獻[8]介紹方法轉化、篩選和鑒定，將鑒定正確的重組質粒命名為pVAX1-PreBoIFN-γ，并將陽性克隆送聯合基因科技有限公司進行 DNA序列測定。

1.5 重組質粒pVAX1-PreBoIFN-γ轉染COS-7細胞及間接免疫熒光鑒定

將重組質粒 pVAX1-PreBoIFN-γ轉染 COS-7細胞，6% CO2、37 ℃孵育6 h后吸去轉染混合物，6%CO2、37 ℃繼續培養。轉染后48 h，棄細胞上清，使用PBS將轉染細胞洗滌3次，用?20 ℃的無水乙醇:丙酮 (2∶3) 混合液室溫固定 5 min，以 1∶500稀釋抗BoIFN-γ高免血清為一抗，以1∶500稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，PBST洗滌后熒光倒置顯微鏡下觀察結果。

1.6 原核重組質粒pET-30a-BoIFN-γ、pGEX-6p-1-BoIFN-γ的構建及鑒定

以 pVAX1-PreBoIFN-γ為模板，以引物 Ps2：(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點)，Pa2：5′-TTTGAATTC TTACGTTGATGCTCTCCG-3′ (下劃線部分為 EcoRⅠ酶切位點) 擴增不含信號肽的450 bp成熟BoIFN-γ基因。將純化回收的 BoIFN-γ擴增產物經 BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶切后，分別克隆入原核表達載體pET-30a(+) 和pGEX-6P-1中，參照文獻[8]介紹的方法轉化、篩選和鑒定，將鑒定正確的重組質粒分別命名為 pET-30a-BoIFN-γ、pGEX-6p-1-BoIFN-γ。

1.7 重組菌 BL21(DE3)(pET-30a-BoIFN-γ)、BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ) 的誘導表達及蛋白純化

分 別 挑 取 BL21(DE3)(pET-30a-BoIFN-γ)、BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ) 單個陽性重組菌落于3 mL含相應抗生素的LB液體培養基中，37 ℃振搖培養過夜。次日以 1∶100接種至含相應抗生素的LB液體培養基中，于37 ℃中振搖培養至OD值為0.4~0.6 (分別培養3~4 h和2.5~3.5 h) 時，加入IPTG使終濃度分別為0.01 mmol/L和0.05 mmol/L，并分別置于37 ℃和25 ℃誘導培養4~5 h，離心收集菌體，以滅菌PBS洗滌、懸浮。在冰浴中利用超聲波破碎儀裂解菌體 (800 W超聲10 s，間隔20 s)。依次 6 000 r/min 10 min，8 000 r/min 20 min，8 000 r/min 20 min，9 000 r/min 20 min離心裂解上清。將離心后收集的裂解上清分別使用 His-Bind Purification Kit和Sepharose 4B柱進行純化，收集純化融合蛋白rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ，分光光度計測量蛋白質濃度，并進行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.8 重組轉移質粒 pFast-BoIFN-γ和重組穿梭質粒Bacmid-BoIFN-γ的構建及鑒定

將pVAX1-PreBoIFN-γ經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，克隆到轉座載體pFastBacTM1中，參照文獻[8]介紹的方法轉化、篩選和鑒定，將鑒定正確的重組質粒命名為 pFast-BoIFN-γ；參照文獻[9-10]介紹的方法將重組質粒 pFast-BoIFN-γ轉化 DH10Bac，通過位點特異性轉座將 BoIFN-γ基因整合到穿梭載體Bacmid中，將鑒定正確的重組質粒命名為Bacmid-BoIFN-γ。

1.9 重組穿梭質粒Bacmid-BoIFN-γ轉染Sf9細胞及間接免疫熒光鑒定

將重組穿梭質粒Bacmid-BoIFN-γ按Bac-to-Bac系統的操作步驟轉染對數分裂期的Sf9細胞，5 h后吸去轉染混合物，27 ℃繼續培養 72 h以上，直至Sf9細胞出現明顯病變時為止。收集培養上清，避光保存于4 ℃，即為P1代病毒。P1代病毒在Sf9細胞上經2次傳代擴增后，即為P3代病毒。將病毒保存液按1∶100體積比感染Sf9昆蟲細胞，至細胞病變達90%時，棄細胞上清，使用PBS洗滌，吹干后用預冷甲醇固定15 min，同時設野生型桿狀病毒感染細胞為陰性對照；以1∶100稀釋的抗BoIFN-γ單抗 5G4為一抗，以 1∶500稀釋 FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗；PBST洗滌后熒光倒置顯微鏡下觀察結果。

1.10 重組BoIFN-γ抗病毒活性測定

采用微量細胞病變抑制法，參照文獻[11-12]測定原核 rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ和真核rBac-BoIFN-γ的抗病毒活性，以每mL (mg) 干擾素樣品的最高稀釋度仍能保護半數細胞 (50%) 免受病毒攻擊的稀釋度的倒數值定義為1個干擾素單位 (U)。

1.11 重組BoIFN-γ雙單抗夾心ELISA檢測方法的建立

1.11.1 ELISA操作程序的確定

使用包被液 (碳酸鹽緩沖液，pH 9.6) 稀釋包被單抗5G4，100 μL/孔，置于4 ℃過夜包被；按常規方法洗滌 (洗滌液：含0.05% Tween-20的PBS，pH 7.4) 和封閉 (封閉液：含1% BSA的洗滌液)；用稀釋液 (稀釋液：含1% BSA、0.05% Tween-20的 PBS，pH 7.4) 稀釋抗原，100 μL/孔，37 ℃孵育1.5 h；洗滌 3次，加入稀釋液稀釋的檢測抗體Biotin-3E6，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h；洗滌 3 次，加入稀釋液 1∶3 000稀釋的 Streptavidin-HRP，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；洗滌3次，加入現配的OPD 100 μL/孔，避光反應15 min后，加入終止液(2 mol/L H2SO4) 50 μL/孔，讀取吸光值 (OD492)。

1.11.2 ELISA最佳反應條件的確定

使用包被液將包被抗體稀釋至5、10、20和40 μg/mL，用稀釋液將檢測抗體作 1∶500、1∶1 000、1∶2 000和1∶4 000稀釋，對重組BoIFN-γ進行檢測，以確定包被抗體和檢測抗體的最佳使用濃度，其他步驟均按照1.11.1中ELISA操作程序。

1.11.3 重組BoIFN-γ的定量分析

使用包被液將包被抗體稀釋至10 μg/mL，將重組 BoIFN-γ用稀釋液作倍比稀釋后，每個稀釋度做2個復孔平行加入ELISA板中，以1∶2 000稀釋的生物素標記抗體為檢測抗體，按相同方法進行ELISA分析，測定 OD492值，以抗病毒活性單位為橫坐標，OD492值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.12 真核rBac-BoIFN-γ表達條件的優化

將重組桿狀病毒保存液依次進行 1∶100、1∶500和1∶1 000體積比稀釋后感染Sf9昆蟲細胞，并分別于感染后 0、24、48、72、96、120、144、168、192 h吸取上清，通過建立的雙單抗夾心ELISA方法測定干擾素的抗病毒效價，確定不同病毒接種量及不同感染時間對蛋白表達的影響，從而選擇最佳的條件進行重組蛋白的大量表達。

2 結果

2.1 pVAX1-PreBoIFN-γ轉染COS-7細胞結果

通過間接免疫熒光試驗檢測 PreBovIFN-γ基因的表達，結果顯示，pVAX1-PreBovIFN-γ轉染的COS-7細胞可見強烈的綠色熒光 (圖 1A)，而空載體質粒pVAX1轉染和處理后未見熒光 (圖1B)。

圖1 COS-7細胞轉染試驗結果Fig. 1 Immunoflurescence analysis of transfected COS-7 cells.(A) COS-7 cells transfected with recombinant plasmid pVAX1-PreBovIFN-γ. (B) COS-7 cells transfected with plasmid pVAX1.

2.2 重 組 菌 BL21(DE3)(pET-30a-BovIFN-γ)、BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ) 表達產物及其純化產物的SDS-PAGE分析

取 重 組 菌 BL21(DE3)(pET-30a-BoIFN-γ) 、BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ) 未誘導和誘導后的全菌裂解上清、純化蛋白進行 SDS-PAGE電泳 (圖 2、3)。電泳結果表明 BoIFN-γ基因在重組菌中獲得成功表達，分別于分子量為23、43 kDa處有一明顯的增量蛋白帶，與預期融合蛋白的分子量和純化產物大小一致，而未誘導菌在相應分子量處未見此條帶。

2.3 間接免疫熒光檢測rBac-BoIFN-γ表達

以抗BoIFN-γ單抗5G4為一抗分別檢測野生型桿狀病毒感染 Sf9細胞、重組桿狀病毒感染Sf9細胞，結果顯示，感染重組桿狀病毒的sf9細胞出現明顯綠色熒光 (圖4A)，而感染野生型桿狀病毒的Sf9細胞未見熒光 (圖 4B)，可見 rBac-BoIFN-γ在桿狀病毒系統中得到成功表達。

圖2 rHis-BoIFN-γ的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of rHis-BoIFN-γ. M: protein marker; 1: supernatants of lysate of BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ)without induced by IPTG; 2: supernatants of lysate of BL21(DE3)(pET-BoIFN-γ) induced by IPTG; 3: purified rHis-BoIFN-γ protein.

圖3 rGST-BoIFN-γ的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of rGST-BoIFN-γ. M: protein marker;1: supernatants of lysate of BL21(pGEX-6P-1-BoIFN-γ) without induced by IPTG; 2: supernatants of lysate of BL21(pGEX-6P-1-BoIFN-γ) induced by IPTG; 3: purified rGST-BoIFN-γ protein.

圖4 間接免疫熒光檢測 rBac-BoIFN-γ在昆蟲細胞中的表達Fig. 4 IFA detecting expression of rBac-BoIFN-γ in Sf9 cells.(A) Sf9 cells transfected with recombinant plasmid Bacmid-BoIFN-γ. (B) Sf9 cells transfected with plasmid Bacmid.

2.4 重組BoIFN-γ抗病毒活性測定

利用VSV-MDBK細胞系統測定rBoIFN-γ抗病毒活性，大腸桿菌系統表達的 rHis-BoIFN-γ和rGST-BoIFN-γ蛋白活性分別為 8.389×107U/mg和6.554×105U/mg，桿狀病毒系統表達的細胞上清中rBac-BoIFN-γ活性為4.096×104U/mL。結果顯示，原核及真核系統表達的rBoIFN-γ均具有較高的抗病毒活性 (圖5)。

2.5 重組BoIFN-γ的雙單抗夾心ELISA檢測方法的建立及應用

2.5.1 ELISA最佳反應條件的確定

根據方陣實驗結果，確定包被抗體5G4最佳使用濃度為10 μg/mL，檢測抗體Biotin-3E6最佳稀釋倍數為1∶2 000。

圖5 重組BoIFN-γ抗病毒活性測定結果Fig. 5 Antiviral activities analysis of recombinant BoIFN-γ. (A) MDBK cells with VSV. (B) MDBK cells with VSV and recombinant BoIFN-γ. (C) MDBK cells.

2.5.2 重組BoIFN-γ的定量分析

采用雙夾心ELISA的方法分別測定rHis-BoIFN-γ和 rBac-BoIFN-γ，通過倍比稀釋的方法，取抗病毒活性值的對數和 OD值建立標準曲線，通過對數回歸建立標準曲線方程 (圖6)。根據ELISA的OD值(Y值) 利用建立的方程計算重組BoIFN-γ樣品的抗病毒活性值。

圖6 雙單抗夾心ELISA檢測BoIFN-γ標準曲線的繪制Fig. 6 Standard cruve of rBoIFN-γ detection by ELISA. (A)rHis-BoIFN-γ. (B) rBac-BoIFN-γ.

2.6 真核rBac-BoIFN-γ表達水平的優化

由結果可見，不同病毒接種量對重組蛋白表達量的影響不大，但是對于蛋白表達高峰的出現時間有影響，隨著病毒接種量的降低，表達高峰出現時間逐漸往后推移 (圖 7)。由于細胞會逐漸裂解，為防止昆蟲細胞蛋白組分對蛋白產物的污染，以及蛋白產物發生降解，病毒接種量不應太低，蛋白收獲時間不應超過120 h。

圖7 不同接種量和時間對蛋白表達的影響Fig. 7 Influence of vaccination quantity and time point on the production of rBac-BoIFN-γ.

3 討論

干擾素是一類多功能細胞因子，具有抵抗病毒感染、抑制腫瘤細胞生長與調節機體免疫功能的作用。干擾素分為 I型和Ⅱ型兩類，I型干擾素包括IFN-α和 IFN-β，Ⅱ型干擾素 IFN-γ，又稱免疫干擾素。目前在國內外奶牛養殖過程中，出現奶牛乳腺炎、口蹄疫、牛結核等多種疾病，嚴重影響奶牛的產奶產量和質量，還給畜牧場造成了巨大的經濟損失。干擾素作為免疫應答的自然誘導物和調節物，在臨床上具有良好的應用前景。

IFN-γ基因在正常情況下處于封閉狀態，必須在各種特異性或非特異性刺激因子的刺激下才能表達，因此要獲得高效價廉的IFN-γ，需通過基因工程技術大量制備和生產，使其在動物中的應用成為可能。大腸桿菌表達系統具有操作簡單、生產成本低、產量高、易于工業化生產等優點，但是大腸桿菌表達的蛋白多以包涵體或部分可溶的形式存在，不能進行翻譯后的修飾等過程，使其存在活性低、純化復性步驟繁瑣、內毒素難以去除等諸多缺陷，因此在臨床應用中受到一定程度的限制。桿狀病毒表達系統能夠較好地對重組蛋白糖基化和剪切折疊，比原核表達系統更優越，表達產物比活性更高，更適合細胞因子的表達，而且桿狀病毒具有高度的種屬特異性，僅感染昆蟲，對脊椎動物無感染性，其表達產物安全可靠，經過簡單處理即可以直接應用于畜禽疾病的臨床治療。

本研究通過對表達條件的優化，實現了重組BoIFN-γ在大腸桿菌系統中的可溶性表達，及在桿狀病毒系統中的分泌性表達，經抗病毒活性檢測顯示，3種重組蛋白 rHis-BoIFN-γ、rGST-BoIFN-γ和rBac-BoIFN-γ均具有較高生物學活性，為應用于病毒和腫瘤性疾病的治療提供了材料，有望在牛感染性疾病的防治中發揮重要作用。本實驗室通過建立的BoIFN-γ抗原捕獲ELISA法檢測奶牛臨床血漿樣品，并以商品化試劑盒作為平行對照，結果顯示 2種方法檢測符合率達到 83.9%[13]。同時，本研究還建立了BoIFN-γ的雙單抗夾心ELISA檢測方法，并繪制了標準曲線，可測定大腸桿菌和桿狀病毒表達的 BoIFN-γ，定量分析其抗病毒活性，該方法與MDBK/VSV系統所測定結果符合，且比后者更為安全、便捷、準確，為 BoIFN-γ的生物學功能、作用機理的研究及臨床應用提供了一種有效的手段。

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Expression and antiviral assay of bovine interferon-γ

Zhengzhong Xu*, Xiang Chen*, Fengli Shan, Chuang Meng, Lin Sun, Jinlin Huang, Zhiming Pan,Shizhong Geng, and Xin’an Jiao
Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China

Received: July 5, 2010; Accepted: September 21, 2010

Supported by: Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 06104396).

Corresponding author: Jie Wang. Tel: +86-20-36654245; E-mail: jiew@tom. com

廣東省自然科學基金項目 (No. 06104396) 資助。