重組質粒pUDK-HGF的中試純化工藝

胡春生，王延亮，盧育新，程曉晨，劉琳，張通，張慶林

1 軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京 100850

2 內蒙古工業大學化工學院，呼和浩特 010051

重組質粒pUDK-HGF的中試純化工藝

胡春生1,2，王延亮1，盧育新1，程曉晨1，劉琳1，張通2，張慶林1

1 軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京 100850

2 內蒙古工業大學化工學院，呼和浩特 010051

pUDK-HGF是攜帶人肝細胞生長因子的裸質粒，目前已進入I期臨床試驗，因此需要大量符合藥學規格的質粒DNA。文中建立了pUDK-HGF中試規模純化制備的新工藝。流程包括：發酵、離心收獲菌體、堿裂解、超濾濃縮堿裂解液、Sephacryl S-1000層析除去RNA并更換緩沖液、plasmidselect捕獲超螺旋質粒DNA、瓊脂糖凝膠6BFF除鹽。新工藝可獲得濃度為2.0 mg/mL、純度在1.70以上的裸質粒原液，符合相關質量標準，并避免使用動物源性的酶及有毒試劑。

重組質粒，純化，質量檢測，肝細胞生長因子

Abstract:pUDK-HGF, the recombinant plasmid DNA encoding human hepatocyte growth factor (HGF), can treat ischaemic disease. A great quantity of pharmaceutical pUDK-HGF is needed. A pilot-scale production process of pUDK-HGF was established based on a new chromatographic media (plasmidselect), including fermentation, cell harvesting, alkaline lysis, ultrafiltration, RNA removing and buffer exchanging on Sephacryl S-1000, capturing supercoiled plasmid DNA with plasmidselect, and removing the salt with Sepharose 6BFF. The process does not use RNase enzyme and toxic solvents.

Keywords:recombinant plasmid, purification, hepatocyte growth factor

肝細胞生長因子 (Hepatocyte growth factor，HGF) 是一類多功能生長因子，具有刺激血管增生作用，通過局部肌肉注射攜帶HGF基因的質粒DNA可明顯促進肢體急性缺血部位新生血管的形成，在臨床上具有治療缺血性疾病的應用前景[1]。

Zhang等[2]對質粒pUDK-HGF大規模純化工藝進行了大量研究，工藝成熟，能生產藥用級重組質粒pUDK-HGF注射液。其工藝是堿裂解后離心處理獲得澄清堿裂解液，直接用Q-Sepharose XL陰離子交換層析捕獲質粒DNA；再用Sephacryl S-1000分離除去RNA；用Source 15Q對質粒DNA進行精制。隨著新填料 plasmidselect的出現，生產超螺旋質粒 DNA的工藝隨之更新，因此本文建立新的pUDK-HGF純化工藝，該工藝為堿裂解細菌后，用綢布濾去細胞碎片等絮凝物，獲得堿裂解上清液；上清液經300 kDa超濾柱進行濃縮，獲得的濃縮液經 Sephacryl S-1000層析柱除去 RNA，然后通過plasmidselect層析柱對超螺旋質粒DNA進行捕獲，獲得高純度的超螺旋質粒DNA，再通過瓊脂糖凝膠6BFF對超螺旋質粒DNA進行脫鹽；最終采用異丙醇沉淀質粒DNA，75%乙醇洗滌，配方溶液重溶獲得產品。

1 材料與方法

1.1 菌株

表達重組人肝細胞生長因子的基因工程菌E. coli DH5α-pUDK-HGF 由本室構建，?80 ℃甘油保存。

1.2 材料

Tris(Angus)、DNAGreen (北京天恩澤基因科技有限公司)、十二烷基硫酸鈉 (Amresco)、限制性內切酶 (TaKaRa)、胰蛋白胨 (OXOID)、酵母提取物(OXOID)、甘油、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸、氨水、硫酸銨、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸鉀、氫氧化鈉、冰乙酸、異丙醇、乙醇、葡萄糖 (以上化學試劑均來自國藥集團化學試劑有限公司，分析純)。

1.3 發酵

E. coli DH5α-pUDK-HGF菌種經 LB培養基[3]搖床培養12 h，以接種量10%轉入含TB培養基[3]50 L發酵罐 (KBT250，韓國) 中，發酵體積30 L，發酵溫度 37 ℃，攪拌速度 300 r/min，空氣流量15 L/min，pH 7.2，發酵時間13 h，每小時分別取樣，測定 OD600及菌體干重[4]。菌體經離心后保存于?20 ℃。

1.4 堿裂解細菌

稱取 400 g細菌，加入重懸液 (50 mmol/L Glucose，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 4 000 mL；充分重懸后在冰浴上加入裂解液(200 mmol/L NaOH，1% SDS) 4 000 mL，緩慢攪拌，形成粘稠物；隨即加入中和液 (3 mol/L乙酸鉀，5 mol/L CH3COOH) 4 000 mL，形成白色絮凝物，冰浴，靜置1 h。用兩層綢布過濾，獲得堿裂解液。

1.5 超濾濃縮

選用截留分子量為 300 kDa的超濾柱 (型號003N，北京旭邦膜設備有限責任公司) 采用內壓式，泵速15 r/min (BTOO-100M，蘭格恒流泵有限公司)，控制濃縮液流速是超濾液流速的 2倍。超濾后最終體積為500 mL。

1.6 Sephacryl S-1000層析柱去除RNA、更換緩沖液

Sephacryl S-1000 (GE Healthcare) 填料1.5 L裝于5.5 cm×80 cm層析柱中 (上海錦華層析設備廠)，溶液 A (2.0 mol/L (NH4)2SO4，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 平衡，堿裂解濃縮液以柱體積的 10%上樣，上樣結束后溶液 A洗脫，EC2000色譜工作站檢測 (大連依利特分析儀器有限公司)，收集DNA峰。流速為4.5 mL/min。

1.7 Plasmidselect捕獲超螺旋DNA

Plasmidselect (GE Healthcare) 填料55 mL裝于2.6 cm×20 cm層析柱中 (上海錦華層析設備廠)，溶液A平衡，將Sephacryl S-1000收集的DNA溶液上樣，溶液A洗脫3個柱體積，溶液 B (0.02 mol/L NaCl，2.0 mol/L (NH4)2SO4，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 洗脫至基線，溶液C(0.3 mol/L NaCl，1.7 mol/L (NH4)2SO4，100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 洗脫超螺旋質粒 DNA。EC2000色譜工作站檢測，收集超螺旋質粒DNA。流速為3 mL/min。

1.8 瓊脂糖凝膠6BFF除鹽

瓊脂糖凝膠6BFF (北京韋氏博慧色譜科技有限公司) 填料300 mL裝于3.5 cm×40 cm層析柱中 (上海錦華層析設備廠)，TE緩沖液[3]平衡，將收集的超螺旋質粒 DNA以不超過柱體積的 20%上樣，EC2000色譜工作站檢測，收集脫鹽 DNA。流速4.5 mL/min。

1.9 原液制備及超螺旋比例測定

1.9.1 原液制備

量取脫鹽溶液體積按1∶0.8加入異丙醇，沉淀質粒DNA，4 000 r/min離心30 min收集沉淀。沉淀用75%乙醇洗滌2次，空氣干燥，按標示量配制所需濃度。

1.9.2 含量檢測及超螺旋比例測定

含量檢測：原液稀釋125倍，利用紫外分光光度計 (Beckman DU640，USA) 檢測 OD260、OD280。

超螺旋比例測定：Waters高效液相色譜儀(Waters，USA)；色譜柱：TskgelDNA-NPR (0.46 id×7.5 cm，TOSOH，日本)，檢測波長：260 nm，流速0.5 mL/min，流動相 A：20 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0；流動相 B：20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 9.0，進樣量：5 μg，線性梯度洗脫條件：起始比例A∶B為50%∶50%，梯度洗脫30 min，最終A∶B比例為20%∶80%，35 min回到起始平衡色譜柱。

2 結果

重組質粒pUDK-HGF純化制備流程圖見圖1。E. coli DH5α-pUDK-HGF在TB培養基中發酵13 h，動態觀察OD600(圖2)。當細菌進入穩定期后，離心收獲菌體，儲存于?20 ℃備用。測量菌體干重，可知在發酵11 h后菌體就進入穩定期。發酵結束后，取出 1 mL發酵液用北京三博遠志質粒提取試劑盒提取質粒，測含量，發酵液中pUDK-HGF的含量約42 mg/L。

菌體按重量比 1∶10∶10∶10加入重懸液、裂解液、中和液，堿裂解液經過超濾、離心后，直接用Sephacryl S-1000除去RNA、更換緩沖液，獲得質粒DNA (圖3)；plasmidselect捕獲超螺旋質粒DNA(圖 4)，經 0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，在電泳圖上未見RNA，超螺旋DNA與開環DNA完全分離 (圖5)；通過 HPLC檢測，超螺旋質粒 DNA比例在99% (圖 6)；plasmidselect柱捕獲的含高鹽超螺旋質粒DNA經瓊脂糖凝膠6BFF，能達到除鹽的效果(圖7)。利用限制性酶對原液與標準品進行酶切鑒定[5]，結果顯示原液與標準品酶切圖譜一致 (圖8)。

圖1 重組質粒pUDK-HGF制備流程圖Fig. 1 Process flow sheet for pUDK-HGF production.

圖2 50 L發酵罐發酵菌體密度與干重動態曲線Fig. 2 Curve of OD and dry weight of E. coli in 50 L fermentor.

圖3 Sephacryl S-1000層析分離色譜圖Fig. 3 Removing RNA and exchanging buffer on Sephacryl S-1000.

圖4 PlasmidSelect柱層析分離色譜圖Fig. 4 Capturing the supercoiled plasmid DNA on plasmidselect. oc: open circular; sc: supercoiled.

圖5 經Plasmidselect分離后質粒DNA電泳圖Fig. 5 Analysis by 0.8% agarose-gel electrophoresis of purified pUDK-HGF from plasmidselect. 1: loading sample; 2: opened pUDK-HGF; 3: supercoiled pUDK-HGF; M: DNA marker.

圖6 超螺旋比例HPLC分析色譜圖Fig. 6 The supercoiled form of pUDK-HGF analysed by a TskgelDNA-NPR column.

圖7 瓊脂糖凝膠6BFF脫鹽色譜圖Fig. 7 Removing the salt by a sepharose 6BFF column.

圖8 pUDK-HGF限制性內切酶鑒定圖譜Fig. 8 Analysis by 0.8% agarose-gel electrophoresis of restriction enzyme dealing with pUDK-HGF. 1?5: sample;8?12: reference substance; 2 and 12: BamHⅠ, BagLⅡ; 3 and 11: BagLⅡ, SalⅠ; 4 and 10:EcoRⅠ, SalⅠ; 5 and 9:Hind Ⅲ ,Xba Ⅰ ; 1 and 8: plasmid pUDK-HGF; 6: λ-Hind Ⅲ Marker; 7:DNA Marker DL2 000 (2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp).

利用紫外分光光度計 (Beckman DU640，USA)檢測重組質粒 pUDK-HGF原液含量及純度，讀取260 nm與280 nm處光吸收值，根據公式：樣品DNA濃度 (μg/mL) =OD260×50 μg/mL×稀釋倍數計算含量；OD260/OD280比值表示質粒 DNA純度，OD260/OD280比值一般在1.75以上[2]。本工藝能獲得含量為 2.0 mg/mL、OD260/OD280比值為 1.9的原液質粒DNA。

3 討論

基因治療可能成為一些重大疾病如腫瘤、動脈粥樣硬化、骨質疏松癥、關節炎等的治療手段，而基因治療的關鍵是攜帶治療基因的載體能有效進入靶細胞[1]。目前，應用基因治療的載體大致可以分為兩大類，一類是病毒載體，另一類是非病毒載體。臨床上腺病毒載體占 23.8%，反轉錄病毒載體占20.7%，質粒載體占18.3%[6]。雖然病毒載體的轉染率高，但存在一些安全隱患；而質粒DNA在靶細胞中的基因表達效率低、持續時間短，但它在靶細胞中安全性高。國內重組質粒HGF用于治療局部肢體動脈缺血疾病已進入I期臨床試驗。

由于色譜分離技術的高分辨率和種類的多樣性，現仍在生物分離技術中占主導地位。迄今為止，已有大量的色譜分離技術應用于質粒DNA的分離純化，例如：陰離子交換色譜 (Anion exchange，AE)[7]、親和層析色譜 (Affinity chromatography，AC)[8]、疏水交換色譜 (Hydrophobic interaction chromatography，HIC)[9]、反相色譜 (Reverse phase，RP)[10]、排阻色譜 (Size exclusion，SE)[11]。雖然色譜填料價格昂貴，但具有容易放大的優點，適用于工業化生產質粒DNA。

堿裂解細胞是純化過程的關鍵步驟，堿裂解不當會使超螺旋質粒DNA斷裂，開環質粒DNA含量增加；在加入堿裂解液時，要緩慢攪拌均勻，否則會導致局部過堿，造成超螺旋DNA的斷裂；隨后中和液用量也比較關鍵，用量過多，使溶液偏酸性，超螺旋質粒DNA會發生斷裂；用量過少，堿裂解液中和不充分，宿主蛋白、DNA不能完全沉淀，后續純化難度加大。

利用超濾柱對堿裂解液進行濃縮，泵速和液體在管道內的運動形式是控制超螺旋質粒 DNA比例的關鍵。若泵速過高，流體在管道內易形成湍流，剪切力較大，易造成超螺旋質粒DNA大量斷裂；適當控制泵速是超濾濃縮的關鍵，本工藝控制轉速在15 r/min以下可以獲得超螺旋比例高的質粒DNA濃縮液。

Plasmidselect捕獲超螺旋質粒DNA，硫酸銨的離子濃度會影響超螺旋和開環質粒 DNA與plasmidselect的結合能力。硫酸銨濃度低于2.0 mol/L，則超螺旋和開環質粒 DNA均不與 plasmidselect結合；硫酸銨濃度高于2.0 mol/L，則超螺旋與開環質粒DNA均與plasmidselect結合，一方面影響填料對超螺旋質粒DNA的負載量，另一方面影響超螺旋質粒DNA的比例。

Zhang等[2]之前建立的工藝與文中建立的工藝相比，在同等規模下處理堿裂解液，使用的層析填料用量多，生產周期較長。新工藝的建立應用超濾柱對堿裂解液進行濃縮，縮短生產周期，降低生產成本；同時，plasmidselect對超螺旋質粒DNA是特異性吸附，吸附量可達到0.4 mg/mL及以上，獲得的質粒DNA超螺旋比例高。通過本試驗可知，選用截留分子量為300 kDa的超濾柱可有效地濃縮質粒DNA。應用于大規模生產時，濃縮獲得高濃度超螺旋質粒DNA，可以避免用異丙醇或乙醇沉淀質粒時造成大量質粒損失。

REFERENCES

[1] Zhang QL, Li MY, Wu ZZ. Research advance of gene therapy for peripheral arterial disease using hepatocyte growth factor. Chin J Rep Recons Surg, 2006, 20(11):1147?1150.

張慶林, 李敏元, 吳祖澤. 肝細胞生長因子基因治療周圍動脈閉塞癥研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2006,20(11): 1147?1150.

[2] Zhang QL, Bi JJ, Xiao FJ, et al. Production of plasmid DNA encoding human hepatocyte growth factor for gene therapy. Biotechnol Appl Biochem, 2008, 49(Pt 1): 11?16.

[3] Lu SD. Current Protocols for Molecular Biology. Beijing:Higher Education Press, 1993: 571?594.

盧圣棟主編. 現代分子生物學實驗技術. 北京: 高等教育出版社, 1993: 571?594.

[4] Bi JJ, Zhang QL, Wei HD, et al. Effect of growth medium on the yield of recombinant plasmid pcDNA3-HGF. Lett Biotech, 2000, 11(4): 271?274.

畢建進, 張慶林, 魏漢東, 等. 培養基對重組質粒pcDNA3-HGF產率的影響. 生物技術通訊, 2000, 11(4):271?274.

[5] Zhang QL, Xiao FJ, Bi JJ, et al. Quality analysis of recombinant plasmid pUDKH. Lett Biotech, 2006, 17(5):733?736.

張慶林, 肖鳳君, 畢建進, 等. 重組質粒pUDKH的質量分析. 生物技術通訊, 2006, 17(5): 733?736.

[6] Journal of gene medicine. Vectors used in gene therapy clinical trials [EB/OL]. [2009-12-20]. www.wiley.com/legacy/wileychi/genmed/clinical.

[7] Przybylowski M, Bartido S, Borquez-Ojeda O, et al.Production of clinical-grade plasmid DNA for human phase Ⅰ clinical trials and large animal clinical studies.Vaccine, 2007, 25(27): 5013?5024.

[8] Cano T, Murphy JC, Fox GE, et al. Separation of genomic DNA from plasmid DNA by selective renaturation with immobilized metal affinity capture. Biotechnol Prog,2005, 21(5): 1472?1477.

[9] Diogo MM, Queiroz JA, Monteiro GA, et al. Purification of a cystic fibrosis plasmid vector for gene therapy using hydrophobic interaction chromatography. Biotechnol Bioeng, 2000, 68(5): 576?583.

[10] Ferreira GNM. Chromatographic approaches in the purification of plasmid DNA for therapy and vaccination.Chem Engine Technol, 2005, 28(11): 1285?1294.

[11] Urthaler J, Buchinger W, Necina R. Improve downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy. Acta Biochim Pol, 2005, 52(3):703?711.

Pilot-scale production of recombinant plasmid pUDK-HGF

Chunsheng Hu1,2, Yanliang Wang1, Yuxin Lu1, Xiaochen Cheng1, Lin Liu1, Tong Zhang2,and Qinglin Zhang1
1 Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China
2 College of Chemical Engineering, Inner Mongolia University of Technology, Hohhot 010051, China

Received: May 5, 2010; Accepted: July 29, 2010

Supported by: Major Special Projects in National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period(No. 2008ZX10004-015).

Corresponding author: Chengfeng Qin. Tel: +86-10-66948604; Fax: +86-10-63898239; E-mail: cfqin@hotmail.com

國家“十一五”重大科技專項課題 (No. 2008ZX10004-015) 資助。