翻譯后修飾可能影響黃瓜花葉病毒2b蛋白抑制子活性及穩定性

李沫，賈燕濤，方榮祥

1 中國科學院微生物研究所 植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101

2 國家植物基因研究中心，北京 100101

3 中國科學院研究生院，北京 100049

翻譯后修飾可能影響黃瓜花葉病毒2b蛋白抑制子活性及穩定性

李沫1,3，賈燕濤1,2，方榮祥1,2

1 中國科學院微生物研究所 植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101

2 國家植物基因研究中心，北京 100101

3 中國科學院研究生院，北京 100049

黃瓜花葉病毒 (Cucumber mosaic virus，CMV) 編碼的2b蛋白具有RNA沉默抑制子功能，為了研究翻譯后修飾對2b功能的影響，利用反向PCR定點突變方法對CMV-Q株系2b蛋白的1個預測的磷酸化位點 (S40) 和2個預測的泛素化/SUMO化位點 (K22，K39) 進行了點突變，同時將點突變體插入植物表達載體。通過農桿菌共注射法對3個2b突變體的抑制子活性進行了分析，結果證明，當S40突變為A (2bS40A) 后，2b抑制局部和系統沉默的活性均大幅降低；當K22突變為R (2bK22R) 后，2b的抑制子活性無明顯變化；而將K22和K39均突變為R (2bK22R/K39R) 后，2b抑制系統沉默的活性則大幅減弱。對葉片中2b突變體的蛋白含量的Western blotting檢測表明，與野生型2b蛋白相比，2bK22R在植物中積累水平變化不大，而2bS40A和2bK22R/K39R的蛋白積累量則明顯降低，說明K39和S40位點在維持2b蛋白的抑制子活性及其在植物細胞中的穩定性方面起重要作用。

黃瓜花葉病毒，2b蛋白，翻譯后修飾，抑制子活性，蛋白穩定性

Abstract:To gain insights into the function of potential post-translational modifications on the activity of the Cucumber mosaic virus (CMV)-encoded silencing suppressor protein 2b, one predicted phosphorylation site (S40) and two predicted ubiquitination/sumoylation sites (K22 and K39) in CMV-Q2b protein were individually or simultaneously mutated by site-directedmutagenesis methods. These Q2b mutants were inserted into plant expression vectors, expressed in plant leaves, and then analyzed for their silencing suppressor activities. The results showed that S40A mutation greatly impaired both the local and systemic silencing suppressor activity, and the K22R mutation has no significant effect on the suppressor activity, while the K22R/K39R double mutation reduced the systemic silencing suppressor activity. To test if the decrease of suppressor activity were due to protein accumulation changes, western blot were performed to moniter the protein level of Q2b mutants. The results indicated that mutations of both K22 and K39 to R or S40 to A all significantly reduced the accumulation of the Q2b protein in plants, while the single mutation of K22 to R did not alter the accumulation of Q2b protein, suggesting that two potential post-translational modification sites, K39 and S40, contribute to the suppressor activity and stability of 2b protein in plant cells.

Keywords:Cucumber mosaic virus, 2b protein, post-translational modifications, suppressor activity, protein stability

黃瓜花葉病毒 (Cucumber mosaic virus，CMV)是雀麥花葉病毒科黃瓜花葉病毒屬的典型成員，為單鏈正義三分體 RNA病毒[1-2]，是寄主種類最多、分布最廣、對農作物危害最為嚴重的植物病毒之一。CMV RNA2編碼的2b蛋白通過RNA2產生的亞基因組 RNA4A表達[3]。RNA沉默系統是植物重要的抗病毒防御機制，針對這套防御機制，病毒進化出抑制子蛋白來幫助自身成功侵染寄主。2b是 CMV的RNA沉默抑制子[4]，可以抑制寄主RNA沉默系統對病毒RNA的降解，促進病毒在寄主植物內的長距離運動[5]和細胞間運動[6]，還可抑制水楊酸介導的病毒抗性[7]，干擾 RNA引發的 DNA甲基化[8]。據文獻報道2b可以通過與AGO1蛋白相互作用抑制其對 RNA剪切來行使抑制子功能[9]，或結合小分子RNA[10-11]和 AGO4蛋白[12]從而抑制 RNA沉默。這些研究為闡明2b的功能機理提供了證據。

研究發現，2b蛋白序列中的一些關鍵結構域和氨基酸位點能夠影響2b的活性。將CMV Q株系2b(Q2b) 中22KRRRRR27序列全部用 A替換，則抑制系統沉默的活性喪失[13]；將 CMV Fny株系 2b(Fny2b) 序列中22KKQRRR27、33RRER36和39KSPSE43中的任一區段缺失，突變體均不能抑制局部沉默，并且結合 siRNA能力減弱[12]；CMV SD株系 2b(SD2b) 缺失64ELIEMYHH71區段后，抑制子活性僅為缺失前的1/18[14]；將CMV CM95R株系編碼的2b蛋白序列中R46突變為C后，抑制子活性減弱，結合siRNA能力減弱[11]。抑制子活性減弱往往伴隨結合siRNA能力的減弱，由此可見，與siRNA結合是2b行使抑制子功能的一個重要途徑。

Q2b是比較弱的RNA沉默抑制子。Q2b蛋白序列中的39KSPSE43區段是一個保守的CKⅡ磷酸化識別基序[13]，在幾乎所有2b蛋白序列中都存在，預測S40位點可能為磷酸化修飾位點。磷酸化是植物蛋白最主要的翻譯后修飾，在防御信號級聯反應中起重要作用。Q2b中僅含 2個賴氨酸殘基 (K22，K39)，分別位于核定位信號區[13,15]和磷酸化區[13]。賴氨酸往往是泛素化或 SUMO化等翻譯后修飾位點，被修飾蛋白的功能活性常常通過亞細胞定位改變或蛋白降解等過程得以調控。為了研究植物翻譯后修飾系統是否通過針對2b的修飾而抑制2b活性、保護自身不被病毒感染，或者 CMV是否利用寄主植物的翻譯后修飾系統激活 2b的活性幫助病毒感染，將上述S40、K22和K39位點分別突變，并對突變體的功能活性進行檢測分析。結果顯示，這些潛在翻譯后修飾位點參與調控Q2b的抑制子活性及蛋白穩定性。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本名煙Nicotiana benthamiana種子為本實驗室保存，GFP轉基因本名煙株系16c種子為英國劍橋大學植物學系Dr. David Baulcombe惠贈。所有植物都在土中萌發，之后移入小盆，在溫室中培養，溫度25 ℃，16 h光照，8 h黑暗。待生長有5~6片成熟葉片時即可用于農桿菌注射。

1.2 質粒載體與菌株

含Q2b表達框的載體p35S-Q2b-3HA為本實驗室構建。二元載體pCAMBIA1300和含有GFP表達框 (35S:GFP) 的二元載體pCAMBIA1302為Dr. R.Jefferson惠贈。大腸桿菌菌株 E. coli JM109、XL-BLUE和農桿菌菌株A. tumefaciens EHA105為本實驗室保存。

1.3 Q2b定點突變體表達載體的構建

基因定點突變試劑盒購自STRATAGENE。按使用說明設計引物，以 p35S-Q2b-3HA為模板進行反向PCR，反應條件為：95 ℃ 5 min ；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 0 min，24個循環；72 ℃ 10 min ；4 ℃5 min。所得產物用Dpn I消化，37 1℃ h，轉化XL-BLUE感受態細胞，在含氨芐青霉素 (100 μg/mL)的LB平板上篩選陽性克隆，測序確定是否正確突變。

從正確克隆提取質粒，用Hind Ⅲ消化，從瓊脂糖凝膠中回收含C末端3HA標簽的Q2b及其突變體表達框片段，與用Hind Ⅲ消化的pCAMBIA1300載體連接，轉化JM109感受態細胞，在含卡那霉素(50 μg/mL) 的LB平板上篩選陽性克隆，菌落PCR并提質粒Hind Ⅲ酶切鑒定其是否正確。正確克隆即為C末端含有3HA標簽的Q2b及其定點突變體的植物表達載體。本文中所指的Q2b及其突變體蛋白均含有C末端3HA標簽。

1.4 農桿菌注射及GFP觀察記錄

用重組植物表達載體轉化根癌農桿菌 EHA105感受態細胞，在含利福平 (30 μg/mL) 和卡那霉素(50 μg/mL) 的LB平板上篩選轉化子，菌落PCR鑒定正確后，轉入含利福平 (30 μg/mL) 和卡那霉素(50 μg/mL) 的液體 LB 培養基，28 ℃、220 r/min振蕩培養24 h。取20 μL轉入3 mL新鮮液體LB培養基 (含卡那霉素 50 μg/mL，MES 10 mmol/L，乙酰丁香酮 20 μmol/L)，28 ℃、220 r/min 振蕩培養 12 h。3 000 r/min離心10 min收集菌體，用接種緩沖液(10 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L MES pH 5.6，100 μmol/L乙酰丁香酮) 重懸，調整菌液濃度至OD600為1.0。25 ℃靜置3 h后注射葉片。選擇本名煙或16c植物頂端第2片和第3片平展的葉片，用無針頭的針管將菌液注入葉片背面表皮。注射后的植物繼續在25 ℃、16 h光照、8 h黑暗條件下培養。用 100 W 的手提長波長紫外燈 (CA Black Ray model B 100AP) 于暗處照射注射葉片和整株植物，觀測GFP的綠色熒光。使用Canon EOS400D數碼相機拍照，鏡頭加UV鏡和黃色濾光片。

1.5 Western blotting分析

提取葉片總蛋白，用10% Bis-Tris-聚丙烯酰胺凝膠在MES-SDS電泳緩沖液中進行電泳分離，將膠內蛋白濕法轉至PVDF膜 (Millipore) 上，條件為恒壓80 V，100 min。用抗GFP的兔來源多克隆抗體或抗 HA的鼠來源單克隆抗體孵育，再用堿性磷酸酶標記的羊抗兔或羊抗鼠抗體 (Promega) 孵育。用BCIP/NBT系統 (Promega) 顯色。每組實驗均重復5次以上，選擇其中最顯著的效果圖。

2 結果

2.1 S40位點突變后Q2b抑制子活性下降

通過農桿菌共注射將GFP和Q2b或Q2bS40A在野生型本名煙葉片中共表達，3 d后在紫外光下拍照記錄注射葉片中 GFP的表達情況以檢測 Q2b及Q2bS40A抑制局部沉默的活性[4,16]，并通過 Western blotting檢測葉片浸潤部位中的GFP表達量。結果顯示，當S40突變為A后，Q2bS40A抑制局部沉默的活性大幅削弱 (圖1)。與單獨表達GFP的葉片相比，與 Q2b共表達的 GFP熒光明顯更強，說明野生型Q2b具有抑制子活性。而與 Q2bS40A共表達的 GFP熒光和與Q2b共表達的GFP熒光相比減弱許多，接近于單獨表達的GFP熒光 (圖1A)。同時，Western blotting結果也同樣顯示，與Q2bS40A共表達的GFP蛋白積累量明顯少于與 Q2b共表達的 GFP蛋白(圖 1B)。其中野生型本名煙葉片被用作陰性對照(CK-)，轉GFP基因本名煙株系16c葉片被用作陽性對照 (16c)。

圖1 S40位點是Q2b局部沉默抑制子活性所必需Fig. 1 S40 is essential for the local silencing suppressor activity of Q2b. (A) GFP fluorescence co-expressed with Q2bS40Ais weaker than that co-expressed with Q2b. (B)Accumulation level of GFP co-expressed with Q2b or Q2bS40Ain Nicotiana benthamiana leaves.

通過農桿菌共注射將GFP和Q2b或Q2bS40A在16c植物葉片中共表達，每組6~10株植物，取8 dpi、10 dpi和12 dpi這3個時間點記錄注射后16c植株上系統沉默的發生情況，平行重復 3次，計算沉默率以反映 Q2b或 Q2bS40A抑制系統沉默的活性[16]，在10 dpi于紫外光下拍照記錄兩組共注射植株發生系統沉默的情況。結果顯示，在8 dpi時Q2b抑制沉默效率接近100%，與之共表達的GFP僅使3%的16c植株發生GFP系統沉默，而此時Q2bS40A抑制沉默效率只有48%，即與之共表達的GFP使52%的 16c植株發生 GFP系統沉默；在 10 dpi時，Q2bS40A幾乎不能抑制GFP系統沉默，抑制沉默效率降為19%，而此時Q2b仍有88%的抑制沉默效率，只有12%的16c植株發生GFP系統沉默(圖 2A)。此外，在10 dpi時Q2bS40A與GFP共注射的16c植株頂部新生葉片葉脈呈紅色，顯示該處GFP發生系統沉默，而Q2b與GFP共注射的16c植株頂部新生葉片葉脈呈綠色，表明GFP未發生系統沉默(圖 2B)。

圖2 S40位點是Q2b抑制系統沉默所必需Fig. 2 S40 is essential for Q2b suppression of systemic silencing. (A) S40A mutation reduces the Q2b’s ability to suppress systemic silencing. (B) Q2b S40A mutant can not suppress systemic silencing of GFP.

綜合以上結果可知，S40位點對于Q2b的抑制子活性是必需的，將S40突變為A后，Q2b抑制局部沉默和系統沉默的活性均大幅減弱。絲氨酸是潛在的磷酸化修飾位點，但是，是否是由于該位點的磷酸化修飾影響了Q2b的抑制子活性還需要進一步的實驗證據。

2.2 K39位點突變后Q2b抑制系統沉默活性下降

利用同樣的方法，分別檢測 Q2bK22R和Q2bK22R/K39R突變體抑制植物局部沉默和系統沉默的活性，與Q2b的抑制子活性進行比較。

局部沉默活性檢測發現，當K22突變為R后，與 Q2bK22R共表達的 GFP熒光和與 Q2b共表達的GFP熒光相比差異不明顯，而當K22和K39均突變為R后，與Q2bK22R/K39R共表達的GFP熒光和與Q2b共表達的GFP熒光相比明顯增強。同時，提取葉片浸潤部位總蛋白，用GFP抗體作Western blotting檢測GFP表達量，計算4組樣品5次實驗的GFP表達量平均值。

統計數據顯示，Q2bK22R抑制局部沉默的效果和Q2b相比沒有特別明顯的差異，而Q2bK22R/K39R抑制局部沉默的效果則要好于前兩者，與之共表達的GFP增加了約一倍 (圖3)。這與觀察到的GFP熒光結果接近，暗示K39位點可能對Q2b抑制局部沉默活性有負調控作用。

圖3 K22R與K39R突變對Q2b抑制局部沉默活性的影響Fig. 3 Influence of K22R and K39R mutation on the local silencing suppressor activity of Q2b. Q2b, Q2bK22Rand Q2bK22R/K39Rall differentially increased the accumulation levels of the co-expressed GFP proteins.

系統沉默抑制活性檢測結果比較復雜。從共注射植物沉默率統計結果中可以看到，K22R和K22R/K39R兩種突變都使得 Q2b抑制GFP系統沉默活性下降，沉默率在10 dpi時均超過50% (圖4B)。但是，和 Q2b一樣，Q2bK22R仍可抑制頂部新葉中GFP的沉默，使GFP沉默局限在部分葉片的葉脈部位，整株植物在紫外光下呈綠色；而Q2bK22R/K39R則不能抑制頂部新葉中GFP的沉默，整株植物在紫外光下呈紅色 (圖 4A)。因此，K39位點是 Q2b抑制系統沉默所必需的。我們推測該位點潛在的翻譯后修飾對Q2b抑制系統沉默有重要作用，但是K39位點單突變的影響還需進一步的試驗證明。

2.3 K39和S40位點突變影響Q2b在植物中的積累量

用農桿菌注射法將Q2b及其突變體的植物表達載體轉入本名煙葉片，3 d后，提取葉片浸潤部位總蛋白，通過 Western blotting檢測在葉片中表達的Q2b、Q2bK22R、Q2bK22R/K39R、Q2bS40A四種蛋白的積累量，結果顯示，在浸潤葉片中，Q2bK22R和 Q2b相比沒有變化，均可以被檢測到，而Q2bK22R/K39R和Q2bS40A則不能被檢測到 (圖5)。這一結果暗示，K39和S40這2個潛在翻譯后修飾位點對Q2b蛋白的積累量起關鍵作用，有可能影響Q2b在植物中的穩定性。

圖4 K39位點是Q2b抑制系統沉默所必需Fig. 4 K39 is essential for Q2b suppression of systemic silencing. (A) K39R mutation reduces the Q2b’s ability to suppress systemic silencing of GFP. (B) K22R and K22R/K39R mutants of Q2b exhibit reduced ability to suppress systemic silencing.

圖5 K39和S40位點是Q2b在植物中穩定表達所必需Fig. 5 K39 and S40 residues are essential for stable expression of the Q2b protein in plants. Accumulation level of Q2b,Q2bK22R, Q2bK22R/K39Rand Q2bS40Ain Nicotiana benthamiana leaves.

3 討論

目前CMV編碼的2b蛋白作為RNA沉默抑制子已研究得較為深入，其行使功能的部分機理包括與AGO蛋白結合及siRNA結合等功能也得到揭示，但是在蛋白質翻譯后修飾對其功能影響方面的研究還很少。本研究著重對2b蛋白的潛在翻譯后修飾位點進行了分析，發現了2個位點對2b蛋白的沉默抑制子功能至關重要。其中，S40位點對Q2b抑制局部沉默和系統沉默的活性都很重要，將其變為A后，Q2bS40A抑制子活性大幅下降；另外，K39位點對Q2b抑制系統沉默活性也很重要，將其變為R后，Q2b抑制系統沉默活性基本喪失。

絲氨酸是常見的磷酸化修飾位點，將絲氨酸突變為丙氨酸可以阻斷該位點的磷酸化修飾。磷酸化對于植物病毒運動蛋白在細胞間運動是必要的[17]，Q2b也被認為具有部分運動蛋白的功能[5-6]，因此，Q2bS40A減弱的抑制子活性可能是因為磷酸化修飾被阻斷影響2b蛋白在細胞間運動所造成的結果。而賴氨酸是泛素化或SUMO化等翻譯后修飾發生的位點，將賴氨酸替換為結構類似的精氨酸后并不會很大程度上影響蛋白質的二級和三級結構，但是其泛素化或SUMO化等翻譯后修飾則被阻斷。若該位點的賴氨酸為多聚泛素化修飾位點，突變為精氨酸后會導致蛋白不能被泛素-蛋白酶體途徑降解，積累量將提高；若該位點的賴氨酸為單泛素化修飾位點，則突變為精氨酸后會改變蛋白的定位或活性。在我們的研究結果中，K39突變為R后，2b蛋白積累量下降，因此推測該突變可能阻斷了單泛素化或SUMO化修飾，引發Q2b的蛋白定位或活性發生改變，使Q2b抑制系統沉默的活性減弱。

本研究結果證明，Q2b的潛在翻譯后修飾位點對其抑制子活性非常重要。其中一種可能性是影響其在植物中的積累水平。因為當將S40變為A或K39變為R后，通過Western blotting在葉片中均檢測不到Q2b蛋白的存在。此前有文獻報道，將CMV Fny株系編碼的2b蛋白序列中潛在磷酸化區39KSPSE43整體缺失后，2b蛋白在植物中的積累量下降，而只將S40變為A，2b仍然能夠正常積累，相應地，2b抑制局部沉默的活性與其在植物中的積累量相關[12]。在本實驗中，S40位點變為A后，Q2b在植物中的積累量下降，抑制子活性也減弱；K39位點變為 R后，Q2b在植物中的積累量下降，但只有抑制系統沉默的活性減弱，抑制局部沉默的活性似乎還有增強。這就說明除了蛋白積累量之外還有其他因素在影響Q2b的抑制子活性，我們推測該突變可能改變Q2b的翻譯后修飾狀態，有利其與RNA沉默效應元件作用，從而增強其抑制局部沉默的活性。

CMV 2b蛋白的穩定性較差，無論在體內還是體外都不容易檢測純化，這給針對它的研究工作帶來不少困難，全長2b蛋白的晶體結構至今未能被解出。我們的工作立足于蛋白質翻譯后修飾，在找出對2b功能有影響的潛在翻譯后修飾位點后，最終的目標是明確2b蛋白在植物中的翻譯后修飾狀態。目前，檢測2b蛋白翻譯后修飾狀態的有效方法仍在探索中，我們期待今后能夠在這方面有所突破，從而揭示翻譯后修飾調控2b功能活性的分子機理。

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Implication of post-translational modifications in suppressor activity and stability of the Cucumber mosaic virus 2b protein

Mo Li1,3, Yantao Jia1,2, and Rongxiang Fang1,2
1 State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
2 National Center for Plant Gene Research, Beijing 100101, China
3 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Received: May 4, 2010; Accepted: August 18, 2010

Corresponding author: Xunli Liu. Tel: +86-538-8249131; E-mail: xlliu@sdau.edu.cn