化學(xué)添加劑提高重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶制劑穩(wěn)定性

鄭賢良，吳丹，李兆豐，陳堅(jiān)，吳敬

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

化學(xué)添加劑提高重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶制劑穩(wěn)定性

鄭賢良1,2，吳丹1,2，李兆豐1,2，陳堅(jiān)1,2，吳敬1,2

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

通過向重組 α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (α-CGT酶) 液中添加化學(xué)添加劑以提高其熱穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性。在不同溫度下研究了添加劑對(duì)酶液的貯存穩(wěn)定性影響，并用圓二色譜 (CD) 研究了CGT酶在近紫外區(qū)和遠(yuǎn)紫外區(qū)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性的變化關(guān)系。當(dāng)單獨(dú)加入各種添加劑在50 ℃水浴1 h和室溫放置108 d后，發(fā)現(xiàn)含有20%甘油的酶液穩(wěn)定性最好，與未加任何添加劑的對(duì)照酶液相比仍有91%和50%的酶活，對(duì)照酶液在50 ℃水浴1 h后僅有小于10%的活性，室溫放置108 d后已經(jīng)沒有酶活。明膠、CaCl2和PEG400也有一定的保護(hù)效果。將4種保護(hù)劑分別以最佳濃度組合疊加添加到CGT酶發(fā)酵液中40 ℃貯存45 d，CGT酶的殘酶活幾乎不變，維持在100%左右。通過變溫圓二色光譜分析α-CGT酶α-螺旋和β-折疊變化，發(fā)現(xiàn)了保護(hù)劑可以明顯降低高溫條件下酶的變性程度，有利于維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)及天然三維構(gòu)象，使酶在高溫時(shí)保持較高的酶活?；瘜W(xué)添加劑可以明顯提高α-CGT酶酶制劑的穩(wěn)定性，為CGT酶的工業(yè)化應(yīng)用提供穩(wěn)定劑復(fù)配的方法，同時(shí)蛋白質(zhì)的變溫圓二色譜分析也為其他蛋白酶熱穩(wěn)定性研究提供了理論依據(jù)。

α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，化學(xué)添加劑，熱穩(wěn)定性，圓二色光譜

Abstract:To enhance the thermostability and storage stability of α-cyclodextrin glycosyltransferase (α-CGTase), we added specific chemical additives into the preparation of α-CGTase, and studied the effect of additives on the storage stability ofα-CGTase at different temperatures. Then we measured the protein structure of CGTase in the far UV (200?250 nm) and near UV(250?320 nm) ranges respectively by Circular dichroism (CD) spectra under high temperature and analyzed the relationship between thermostability and protein structure. The results indicated that the addition of selected additives (gelatin, glycerin, CaCl2and PEG400) enhanced the thermostability of α-CGTase dramatically. After 45 days, the preparation of α-CGTase still had 100%of the enzyme activity with different additives superimposed at the optimum concentration at 40 °C. The CD spectra of α-CGTase showed that glycerin could protect the secondary and the tertiary structure of the CGTase under high temperature and therefore the enzyme maintained its high activity. Chemical additives can improve the stability of α-CGTase significantly and they preserve the enzyme activity by protecting its secondary structure.

Keywords:α-cyclodextrin glycosyltransferase, chemical additives, thermostability, circular dichroism

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶 (CGT酶，EC 2.4.1.19)是一個(gè)很重要的多功能酶，能催化 3種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)(歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)和耦合反應(yīng)) 和水解反應(yīng)。通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)，CGT酶能將淀粉或淀粉類似物轉(zhuǎn)化為環(huán)糊精[1-2]。由于環(huán)糊精能與客體分子形成包含復(fù)合物，改變客體分子的物理和化學(xué)性質(zhì)，因而在分析化學(xué)、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)、醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的用途[3]。另外，CGT酶還可通過偶合和歧化反應(yīng)，淀粉或糊精轉(zhuǎn)化為單糖、雙糖或低聚糖，然后將這些糖分子作為供體轉(zhuǎn)移到各種受體分子上，從而改善受體分子的性質(zhì)。如CGT酶可催化低聚糖轉(zhuǎn)移到蔗糖或果糖上制備具有難蝕性的偶合糖，還可催化甜菊苷、L-抗壞血酸、鼠李糖等進(jìn)行糖基化，顯著提高這些物質(zhì)的使用性能[4]。

在工業(yè)化酶制劑中，酶的熱穩(wěn)定性是很關(guān)鍵的一個(gè)因素。酶的熱穩(wěn)定性高不僅可以延長(zhǎng)酶的儲(chǔ)存時(shí)間、減少酶在運(yùn)輸過程中酶活的損失，而且可以使酶在較高反應(yīng)溫度下延長(zhǎng)酶的反應(yīng)時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，從而有效地降低生產(chǎn)成本。在液體酶中直接加入穩(wěn)定劑做成液體酶制劑是一種常用的、經(jīng)濟(jì)有效的方法。如Mudeppa Devaraja Gouda等向葡萄糖氧化酶中添加NaCl和K2SO4，較不添加前酶半衰期提高了30多倍[5]；劉彩琴等向α-半乳糖苷酶液中加入甘露醇和海藻糖等，使其半衰期提高了2倍[6]；Zhi等通過向氯化物過氧化物酶中添加PEG200、甘油、海藻糖等，顯著地提高了其貯存穩(wěn)定性[7]。由于在工業(yè)化環(huán)糊精生產(chǎn)中，酶與底物的反應(yīng)溫度一般是50 ℃~60 ℃，這就要求酶在50 ℃左右仍具有良好的穩(wěn)定性。前期我們發(fā)現(xiàn)來(lái)源于 Paenibacillus macerans的天然α-CGT酶或重組酶酶制劑的熱穩(wěn)定性均較差，不利于其工業(yè)化水平的利用，有關(guān)CGT酶酶制劑熱穩(wěn)定性研究目前也未見報(bào)道。本研究分析各種穩(wěn)定劑如糖類、多元醇類、蛋白類、多聚體、金屬離子等化學(xué)物質(zhì)對(duì)α-CGT酶熱穩(wěn)定性的影響，通過各種穩(wěn)定劑的復(fù)配以顯著提高其應(yīng)用穩(wěn)定性及其貯存穩(wěn)定性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究不同條件下酶的熱穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔性及運(yùn)動(dòng)性與功能有密切關(guān)系，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在外界條件下發(fā)生去折疊或部分去折疊時(shí)，蛋白質(zhì)的相應(yīng)功能可能就會(huì)發(fā)生變化。近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)的構(gòu)象對(duì)其生理功能的巨大意義，而圓二色光譜 (Circular dichroism spectra，簡(jiǎn)稱CD) 技術(shù)作為研究稀溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)或多肽構(gòu)象的一種重要手段，已受到研究者的廣泛關(guān)注[8-9]。α-CGT酶屬于α-淀粉酶家族 (家族13)，是一種重要的淀粉轉(zhuǎn)化酶。對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)α-CGT酶分子結(jié)構(gòu)中除了具有與α-淀粉酶相同的A、B、C結(jié)構(gòu)域之外，還存在另外2個(gè)結(jié)構(gòu)域，D和E結(jié)構(gòu)域[10]。A域是催化 (β/α)8-桶區(qū)域；B域是一個(gè)環(huán)區(qū)域，可與底物結(jié)合；C是一種 β-三明治結(jié)構(gòu)，具有結(jié)合麥芽糖或原淀粉的功能；D域也存在β-片狀結(jié)構(gòu)，其功能還未知；E域是結(jié)合淀粉的區(qū)域。由于α-CGT酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而其在熱作用下結(jié)構(gòu)變化目前還沒有詳細(xì)研究，因此有必要研究其在加熱下酶結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定變化機(jī)理。本研究通過CD來(lái)研究在不同溫度下酶結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化，從而闡明酶的不穩(wěn)定變化規(guī)律，為提高其他酶制劑熱穩(wěn)定性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 重組α-CGT酶粗酶液的制備

采用E. coli BL21(DE3) 宿主菌發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)源于Paenibacillus macerans的 α-CGT 酶，4 ℃、10 000 r/min離心20 min除菌體，收集培養(yǎng)物上清液。

1.1.2 主要儀器

Unic7200型分光光度計(jì)購(gòu)自尤尼柯上海儀器有限公司，蛋白電泳儀購(gòu)自美國(guó) BIO-RAD公司，Eppendorf核酸蛋白定量?jī)x購(gòu)自 Eppendorf公司，Mos-450/AF-CD圓二色光譜儀購(gòu)自法國(guó) Biologic公司。

1.2 方法

1.2.1 α-CGT酶活力的測(cè)定

甲基橙法測(cè)定酶環(huán)化活力：將適當(dāng)稀釋的發(fā)酵上清液加入裝有用50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 6.0)配制1%(W/V) 可溶性淀粉溶液的試管中，40 ℃反應(yīng)10 min，加入1.0 mL 1.0 mol/L的鹽酸停止反應(yīng)，再加入 1.0 mL用50 mmol/L磷酸緩沖液配制的0.1 mmol/L 甲基橙，20 ℃保溫 20 min，測(cè)定OD505。一個(gè)酶活單位 (U) 定義為在上述條件下每分鐘生成1 μmol的α-環(huán)糊精所需的酶量。

1.2.2 α-CGT酶最適貯存濃度和pH的選擇

將發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min離心20 min除菌體后，取上清，用超濾儀將發(fā)酵液濃縮，用磷酸鹽緩沖液調(diào) pH分別為 7.0、6.5、6.0，并稀釋得到蛋白濃度分別為1、2、3、4、5、6 mg/mL。將不同蛋白濃度和 pH的酶制劑在 50 ℃水浴 15 min后，12 000 r/min離心2 min，取上清測(cè)酶液的殘酶活。

1.2.3 α-CGT酶粗酶液長(zhǎng)期貯存情況

在蛋白含量為4 mg/mL，pH為6.5時(shí)，將酶液置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，定時(shí)取樣，測(cè)其殘酶活和蛋白含量。

1.2.4 α-CGT酶保護(hù)劑的篩選及濃度優(yōu)化

向酶液中直接添加一定濃度的明膠、甘油、PEG400、海藻糖、木糖醇、甘露醇、CaCl2、MgSO4與空白酶液一起在50 ℃水浴1 h后，測(cè)α-CGT酶的殘酶活。

將明膠、甘油、PEG400、CaCl2添加到酶液中，明膠的濃度分別為 0.5%、1%和 2%，甘油的濃度分別為 10%和 20%，鈣離子的濃度分別為0.5、1、2 mmol/L，PEG的濃度分別為5%、10%、15%、20%。然后將添加保護(hù)劑的酶液置于 50 ℃水浴1 h，測(cè)殘酶活。

1.2.5 保護(hù)劑對(duì)CGT酶長(zhǎng)期貯存保護(hù)效果的研究

將選定的4種保護(hù)劑，以最佳濃度添加到α-CGT酶液中，將酶液置于4 ℃、25 ℃和37 ℃下，隔一定時(shí)間測(cè)定酶液的殘酶活。

將保護(hù)劑以最佳濃度疊加，添加到 α-CGT酶液中，將酶液置于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱定期取樣測(cè)酶活。

1.2.6 CGT酶的熱穩(wěn)定性與其結(jié)構(gòu)的變化

將α-CGT酶發(fā)酵液經(jīng) (NH4)2SO4沉淀、陰離子交換 Q-Sepharose柱層析、疏水 phenyl-Superose(HR10/10) 柱層析三步純化，獲得表觀電泳純酶蛋白，用圓二色光譜儀分別在遠(yuǎn)紫外區(qū)200~250 nm和近紫外區(qū)250~320 nm對(duì)4 ℃和50 ℃保溫0.5 h后的α-CGT酶液進(jìn)行掃描，得出酶的α-螺旋和三級(jí)結(jié)構(gòu)的譜帶變化，掃描時(shí)的蛋白濃度為0.1 g/L，緩沖液為pH 6.5的磷酸鹽緩沖液。α-螺旋在208 nm和222 nm處表現(xiàn)出2個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶，而近紫外區(qū)肩峰譜帶的變化則反映了酶的三維結(jié)構(gòu)的變化。并用 k2d方法計(jì)算 α-螺旋、β-折疊及無(wú)規(guī)卷曲隨溫度變化而變化的量，與CD譜帶相對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗酶制劑的穩(wěn)定性

已有研究發(fā)現(xiàn)酶制劑的貯存 pH和貯存酶蛋白濃度對(duì)其穩(wěn)定性有一定的影響[11]。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明重組α-CGT酶在pH 6~9.5之間均相對(duì)穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH為6[12]。本研究選擇pH 6和酶制劑濃度為1~6 mg/mL來(lái)研究酶的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖1。從圖1可見，在pH分別為6、6.5、7時(shí)，4 mg/mL的酶制劑在50 ℃處理15 min后殘留活性均高于其他蛋白濃度的酶制劑，可達(dá)到 60%以上，而在4 mg/mL的蛋白濃度下，pH 6.5的酶制劑殘留酶活最高，達(dá)75%。

酶溶液的 pH和蛋白濃度對(duì)酶液的穩(wěn)定性有很大的影響，不同的酶其最適pH也不同，對(duì)于α-CGT酶來(lái)說，其等電點(diǎn)約為5.3，有報(bào)道稱稀蛋白溶液易發(fā)生蛋白質(zhì)器壁吸附[13]，即蛋白質(zhì)與固相表面接觸時(shí)所發(fā)生的吸附現(xiàn)象，且在等電點(diǎn)附近吸附量最大，這種器壁吸附現(xiàn)象使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，即酶的活性喪失，這可能是低蛋白濃度的CGT酶不穩(wěn)定的主要原因，因此增加蛋白質(zhì)的濃度可以降低蛋白質(zhì)的器壁吸附程度，提高溶液中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，但是蛋白質(zhì)濃度過高也不利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，這可能是由于蛋白含量過多易發(fā)生蛋白質(zhì)之間的相互聚集沉淀，從而影響酶的活性。

為了進(jìn)一步考查α-CGT酶的貯存穩(wěn)定性，將以上蛋白含量為4 mg/mL，pH 6.5的粗酶制劑分別在4 ℃、25 ℃和37 ℃貯存，定時(shí)取樣測(cè)酶活，結(jié)果見圖2。當(dāng)酶液在4 ℃和25 ℃貯存時(shí)，T1/2分別為100 d和50 d；在37 ℃貯存時(shí)，α-CGT酶的酶活很快下降，T1/2為2.9 d，1周后酶活完全喪失。此外，觀察發(fā)現(xiàn)置于37 ℃的α-CGT酶粗酶制劑在24 h后便會(huì)產(chǎn)生沉淀，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)沉淀量增多，并且其蛋白含量的變化趨勢(shì)與酶活降低成正相關(guān)，可能是蛋白質(zhì)變性失活凝聚成大分子，從而形成絮狀沉淀，這是由蛋白分子所處的復(fù)雜環(huán)境共同作用的結(jié)果，包括溫度、pH、緩沖液、表面活性劑等[14]。

2.2 化學(xué)添加劑對(duì)酶制劑穩(wěn)定性的影響

圖1 不同蛋白濃度和pH對(duì)CGT酶熱穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Thermal stability of α-CGTase with different protein concentration and pH. The crude enzyme preparation with different pH and protein concentration was heated in 50 °C for 15min, Activity of the unheated sample was taken as 100%, and the percent of the remaining activity of the heated samples was calculated. 1--7 means protein concentration is 1 mg/mL and pH is 7.

圖2 不同溫度下CGT酶酶制劑的貯存穩(wěn)定性Fig. 2 Storage stability of crude α-CGTase preparation. The crude enzyme preparation was incubated in 4 °C, 25 °C and 37 °C. Activity of the sample before incubation was taken as 100%, and the percent of the remaining activity of the incubated samples was calculated.

由于酶的穩(wěn)定性受到各種復(fù)雜因素的影響，因此目前提高酶的穩(wěn)定性是比較大的挑戰(zhàn)之一。近年來(lái)對(duì)于向酶液中添加穩(wěn)定劑來(lái)提高酶的穩(wěn)定性的研究已經(jīng)越來(lái)越多，已經(jīng)證明很多化學(xué)添加劑在穩(wěn)定蛋白酶的天然構(gòu)象方面具有重要作用，比如某些糖類、鹽類和多元醇類等[5,15-16]。本研究選擇了明膠、甘露醇、木糖醇、甘油、海藻糖、PEG400、CaCl2、MgSO4共8種化學(xué)添加劑進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，由于前期試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)貯存的酶液中有微生物生長(zhǎng)，故未向酶液中添加防腐劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在眾多的穩(wěn)定劑中，明膠、甘油、PEG400、CaCl2對(duì)提高酶制劑的熱穩(wěn)定性有較顯著作用，其中甘油對(duì)酶活性測(cè)定具有一定的激活作用，其他添加劑對(duì)酶的活性測(cè)定無(wú)影響。

進(jìn)一步觀察不同濃度的上述4種添加劑對(duì)α-CGT酶酶制劑保護(hù)作用，結(jié)果見表1。從表1所見，50 ℃熱處理1 h后，未添加任何保護(hù)劑的α-CGT酶酶活保留率為10%，而添加了化學(xué)添加劑的酶制劑的熱穩(wěn)定性明顯提高，其酶活保留率最高分別是81%明膠、91%甘油、60% CaCl2和61% PEG400。

鑒于之前 α-CGT酶在 25 ℃和 37 ℃的貯存穩(wěn)定性不是很理想，為了考察以上 4種化學(xué)添加劑對(duì)α-CGT酶酶制劑貯存穩(wěn)定性的影響，向α-CGT酶酶制劑中分別添加的1%明膠、10% PEG400、20%甘油和1 mmol/L CaCl2，其最終蛋白濃度為4 mg/mL，pH為6.5。然后分別在4 ℃、25 ℃和37 ℃考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。

表1 不同濃度化學(xué)添加劑對(duì)CGT酶的保護(hù)效果Table 1 Heat inactivation of enzyme preparation in the presence of chemical additives

如圖3所示，在4 ℃條件下，添加了這4種物質(zhì)后酶制劑的T1/2均為108 d；在25 ℃時(shí)，酶制劑添加1%明膠、10% PEG400、1 mmol/L CaCl2和20%甘油的 T1/2分別為 100、72、64、108 d，分別是未添加保護(hù)劑的對(duì)照組的2倍、1.5倍、1.3倍和 2倍。在 37 ℃，酶制劑添加 1%明膠、10%PEG400、1 mmol/L CaCl2和20%甘油的T1/2分別為23 d、7 d、21 d和36 d，分別是未添加保護(hù)劑的對(duì)照組的7.6倍、2.3倍、7倍和12倍。對(duì)這4種穩(wěn)定劑進(jìn)行復(fù)配以觀察其協(xié)同效果，結(jié)果見圖4。

由圖 4所示，在 40 ℃條件下，未添加任何保護(hù)劑的酶制劑在 4 d后酶活完全喪失；含有明膠+CaCl2和CaCl2+PEG400的酶制劑在21 d后酶活完全喪失；含有甘油+CaCl2+明膠的酶制劑在 45 d內(nèi)仍有 80%的酶活，而含有甘油+CaCl2、甘油+CaCl2+PEG400和甘油+CaCl2+PEG400+明膠的酶制劑45 d內(nèi)酶活基本保持不變。

圖3 化學(xué)添加劑對(duì)CGT酶酶制劑貯存穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Storage stability of crude α-CGTase preparation by chemical additives. (A) Gelatin. (B) PEG400. (C) CaCl2. (D) Glycerin.The crude enzyme preparation was incubated in 4 °C, 25 °C and 37 °C. Activity of the sample before incubation was taken as 100%,and the percent of the remaining activity of the incubated samples was calculated.

圖4 化學(xué)添加劑疊加對(duì)CGT酶酶制劑貯存穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Synthetic effects of chemical additive on the stability of enzyme preparation. The crude enzyme preparation was incubated at 40 °C. Activity of the sample before incubation was taken as 100%, and the percent of the remaining activity of the incubated samples was calculated.

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道部分有機(jī)溶劑、金屬離子、蛋白類、糖類等對(duì) α-淀粉酶家族具有一定的穩(wěn)定作用[17-19]；毛新煥等的研究表明，明膠對(duì)酶穩(wěn)定性的提高有一定作用，這是由于明膠是富含多種氨基酸的多聚陽(yáng)離子膠質(zhì)結(jié)構(gòu)，為酶提供還原性環(huán)境，利于酶保持天然構(gòu)象及酶活[20]；Nielsen等通過 Ca2+對(duì) α-淀粉酶穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶家族含有一個(gè)保守的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，因此Ca2+對(duì)于α-淀粉酶家族的穩(wěn)定性具有積極的作用[18]；Kunihiko等的研究表明，甘油等多元醇類能通過優(yōu)先水合作用，在蛋白質(zhì)表面形成一層有序的水化層，使得酶分子構(gòu)象得以穩(wěn)定[21]；另外，研究表明PEG為非極性多元醇，在酶溶液中能與蛋白質(zhì)的疏水位點(diǎn)相結(jié)合，并且水溶液中的PEG能夠減少蛋白質(zhì)的脫水作用，因此能在較高的溫度下穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)[7]。另外一個(gè)現(xiàn)象是，只要含有甘油，酶制劑的貯存穩(wěn)定性就比較高，前面也提到過甘油對(duì)酶活性的測(cè)定具有一定的激活作用，考慮到CGT酶的測(cè)定條件是40 ℃水浴10 min，若不加甘油酶可能在反應(yīng)過程中會(huì)有一定程度的失活，添加甘油后可能會(huì)防止酶活性的損失，提高酶的催化能力，故測(cè)定的酶活性有10%~20%的提高。根據(jù)Kunihiko[21]和Tsutomu等[22]對(duì)甘油等多元醇對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，由于甘油屬于多元醇類多羥基化合物，在水溶液中與酶分子接觸時(shí)，能產(chǎn)生優(yōu)先水合作用在酶分子表面形成一層有序的水化層；另外當(dāng)溶液中加入甘油，甘油進(jìn)入水晶格形成甘油-水結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)了溶劑結(jié)構(gòu)，甘油的存在增加了蛋白質(zhì)的疏水性，使酶分子結(jié)構(gòu)趨于緊實(shí)，因此甘油能夠顯著提高酶分子的穩(wěn)定性。

2.3 α-CGT酶天然構(gòu)象與熱穩(wěn)定性之間的相關(guān)性

蛋白質(zhì)的圓二色光譜 (CD) 是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡(jiǎn)單、較準(zhǔn)確的方法。從1969年，Greenfield最早用CD光譜數(shù)據(jù)估計(jì)了蛋白質(zhì)的構(gòu)象[23]，此后相關(guān)的 CD研究方法得到了很大發(fā)展[24-25]。CD光譜遠(yuǎn)紫外區(qū) (200~250 nm) 反映的是蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，近紫外區(qū) (250~350 nm) 反映的是蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

為了采用CD研究α-CGT酶天然構(gòu)象與熱穩(wěn)定性之間的關(guān)系，首先必須獲得α-CGT酶的純品。因此將α-CGT酶粗酶液先用硫酸銨鹽析，然后采用兩步法，包括 Q-Sepharose陰離子交換色譜和 phenyl-Superose (HR10/10) 疏水色譜，對(duì)重組α-CGT酶進(jìn)行純化。SDS-PAGE證明了兩步純化后酶蛋白的均一性 (圖 5)。

圖5 純化重組α-CGT酶的SDS-PAGEFig. 5 SDS-PAGE analysis of the purification process of α-CGTase 1: protein marker; 2: purified α-CGTase.

在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋在 208 nm 和222 nm處表現(xiàn)出2個(gè)負(fù)的特征峰，β-折疊在216 nm有一負(fù)譜帶，β-轉(zhuǎn)角在206 nm附近有一正的CD譜帶[26]。將純化的α-CGT酶及添加化學(xué)添加劑后的酶液分別在4 ℃和50 ℃水浴0.5 h后用圓二色光譜在遠(yuǎn)紫外區(qū)進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖6。

蛋白質(zhì)中不同類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的特征光譜可用來(lái)估算二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分含量，近年來(lái)已經(jīng)發(fā)展了很多估算方法，k2d法[27]便是其中之一，k2d法是 Andrade等通過自制網(wǎng)絡(luò)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，將得到的蛋白質(zhì) CD掃描數(shù)據(jù)輸入已設(shè)好的程序中，該程序便可給出α-helix和β-sheet的百分比估算值。k2d服務(wù)器公開訪問網(wǎng)站為 http://www.embl-heidelberg.de/~andrade/k2d/。通過該法可以計(jì)算蛋白樣品在 α-螺旋、β-折疊以及無(wú)規(guī)卷曲含量方面的變化。表 2列出了采用k2d法計(jì)算的結(jié)果。由圖6所示，原酶液、原酶液+PEG400以及原酶液+CaCl2在 50 ℃處理后CD譜在遠(yuǎn)紫外區(qū)相對(duì)于4 ℃處理的對(duì)照變化較大 (圖6A，6B，6C)，其中208 nm和222 nm處α-螺旋分別減少了 0.07、0.19、0.14，216 nm 處 β-折疊分別增加了 0.04、0.12、0.11 (表 2)，但 (α+β) 總的含量呈下降趨勢(shì)，無(wú)規(guī)卷曲總的含量呈上升的趨勢(shì)；當(dāng)酶液中添加甘油、甘油+CaCl2、甘油+CaCl2+PEG400在50 ℃處理后CD譜在遠(yuǎn)紫外區(qū)相對(duì)于4 ℃處理的對(duì)照變化不大 (圖6D，6E，6F)，k2d計(jì)算結(jié)果也可以看出 α-螺旋和 β-折疊含量幾乎沒有變化，無(wú)規(guī)卷曲的含量在2個(gè)溫度下也是相同的 (表2)。

表2 α螺旋、β折疊、無(wú)規(guī)卷曲的含量變化Table 2 Content of α-helix, β-sheet and random

圖6 遠(yuǎn)紫外區(qū)4 ℃和50 ℃的CGT酶圖譜Fig. 6 Far UV region (200?250 nm) CD spectra of α-CGTase in the absence of any additives (A), in the presence of PEG400 (B),CaCl2(C), glycerin (D), glycerin+CaCl2(E), glycerin+ CaCl2+PEG400 (F). The enzyme was incubated at 4 °C and 50 °C for 30 min.

遠(yuǎn)紫外的 CD圖譜主要反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)，近紫外的CD圖譜則可反映酶分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。由圖7可見，經(jīng)過50 ℃熱處理后的酶與對(duì)照相比，天然酶在近紫外CD光譜280 nm和300 nm處的特征峰已經(jīng)基本消失 (圖7A)，表明酶分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本不存在，也就是說α-CGT酶的天然構(gòu)象已經(jīng)被破壞，酶分子已經(jīng)變性失活。Lu等用CD分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化同樣得出了這個(gè)結(jié)果[28]。而在酶液中添加甘油后，經(jīng)過50 ℃熱處理后的酶與對(duì)照相比，在280 nm和300 nm處仍有明顯的特征峰 (圖 7B)，證明 α-CGT酶仍然維持著良好的三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而說明甘油的存在能在高溫時(shí)保護(hù)酶分子的三級(jí)機(jī)構(gòu)，使酶分子在較高的溫度下仍然保持穩(wěn)定。

圖7 近紫外區(qū)4 ℃和50 ℃的CGT酶圖譜Fig. 7 Near UV regions (250?320 nm) CD spectra of native α-CGTase alone (A) and α-CGTase in the presence of glycerin(B). The enzyme was incubated at 4 °C and 50 °C for 30 min.

前面已經(jīng)提到α-CGT酶也是典型的α/β結(jié)構(gòu)模體的酶，也就是說α-螺旋和β-折疊的比率是一定的，合適的 α/β及無(wú)規(guī)卷曲含量與酶的特定功能域的形成及酶的構(gòu)象變化緊密相關(guān)，而酶的天然構(gòu)象的穩(wěn)定對(duì)酶保持其活性是非常重要的[29]。酶的活性直接由α-螺旋和β-折疊的構(gòu)象決定，若α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生改變可能會(huì)影響酶的活性中心及底物結(jié)合域，同時(shí)也可能破壞酶分子的氫鍵或其他結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生酶天然構(gòu)象的不可逆破壞，使底物不能順利地與酶分子結(jié)合使酶失去活性，因此 α/β結(jié)構(gòu)模體的酶分子中其α/β的比率一般是恒定的，特定的α/β比率決定了其特定的天然構(gòu)象，α/β比率改變的越大，造成酶分子構(gòu)象的改變?cè)酱螅阜肿拥腻e(cuò)誤折疊結(jié)構(gòu)越多，從而使酶失去活性；另外，無(wú)規(guī)卷曲的含量越多，酶分子的柔性就越強(qiáng)，也就是說其天然構(gòu)象就越容易改變，使酶的活性中心失去原有的功能，使底物不能與之結(jié)合，從而使酶失活。因此 α/β及無(wú)規(guī)卷曲的含量變化越小，酶分子的天然構(gòu)象變化越小，通過 CD圖譜便可以看出酶液中若有甘油等化學(xué)添加劑的存在能在一定程度上維持酶分子的天然構(gòu)象，進(jìn)而提高酶分子的熱穩(wěn)定性，在高溫時(shí)保護(hù)酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)免遭破壞，使酶能夠在高溫時(shí)較完整地維持其天然構(gòu)象，從而維持其天然活性。

與 CD掃描的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合，在 50 ℃處理0.5 h后，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化較大的原CGT酶僅剩35%的酶活，添加PEG400和CaCl2的酶液還有50%~60%的酶活，而添加甘油、甘油+CaCl2、甘油+PEG400+CaCl2的酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化不大，還有95%以上的酶活，從而證明了這些穩(wěn)定劑可保護(hù)酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定酶的天然三維構(gòu)象，因而提高酶的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本研究分析了在重組 α-CGT酶酶液中添加糖類、多羥基醇類、金屬離子、蛋白類等化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶穩(wěn)定性的影響，篩選出了對(duì)酶穩(wěn)定性作用比較大的4種穩(wěn)定劑——明膠、甘油、PEG400、CaCl2，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合成本因素考慮得到最終復(fù)配方法為：20%甘油 (V/V)、10% PEG400 (V/V)、1 mmol/mL CaCl2。加入復(fù)合穩(wěn)定劑45 d內(nèi)酶液在40 ℃酶活基本保持在 100%左右，其貯存穩(wěn)定性顯著提高。此外，我們通過圓二色光譜研究了天然酶和添加化學(xué)添加劑的酶其天然構(gòu)象的改變與酶分子熱穩(wěn)定性之間的關(guān)系，如圖6和圖7所示，發(fā)現(xiàn)添加穩(wěn)定劑主要是保護(hù)了酶分子的天然構(gòu)象，從而增加了其熱穩(wěn)定性。本研究結(jié)論不僅提供了一種可以較好用來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)酶制劑的復(fù)配方法，而且為研究蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性變化規(guī)律提供了理論基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Chung HJ, Yoon SH, Lee MJ, et al. Characterization of a thermostable cyclodextrin glucanotransferase isolated from Bacillus stearothermophilus ET1. J Agric Food Chem, 1998, 46(3): 952?959.

[2] Van der Veen BA, Uitdehaag JC, Dijkstra BW, et al.Engineering of cyclodextrin glycosyltransferase reaction and product specificity. Biochim Biophys Acta, 2000,1543(2): 336?360.

[3] Jeang CL, Lin DG, Hsieh SH. Characterization of cyclodextrin glycosyltransferase of the same gene expressed from Bacillus macerans, Bacillus subtilis, and Escherichia coli. J Agric Food Chem, 2005, 53(16):6301?6304.

[4] Li ZF, Wang M, Wang F, et al. γ-cyclodextrin: a review on enzymatic production and applications. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 77(2): 245?255.

[5] Gouda MD, Singh SA, Rao AG, et al. Thermal inactivation of glucose oxidase. Mechanism and stabilization using additives. J Biol Chem, 2003, 278(27):24324?24333.

[6] Liu CQ, Ruan H, Fu ML, et al. Method for increasing stability of α-galactosidase. Food Ferment Ind, 2007,33(11): 26?29.

劉彩琴, 阮暉, 傅明亮, 等. 提高 α-半乳糖普酶穩(wěn)定性的研究. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(11): 26?29.

[7] Zhi LF, Jiang YC, Wang YS, et al. Effects of additives on the thermostability of chloroperoxidase. Biotechnol Prog,2007, 23(3): 729?733.

[8] Parrot I., Huang PC, Khosla C. Circular dichroism and nuclear magnetic resonance spectroscopic analysis of immunogenic gluten peptides and their analogs. J Biol Chem, 2002, 277(47): 45572?45578.

[9] Lu RC, Cao AN, Lai LH, et al. Interaction between bovine serum albumin and equimolarly mixed cationic–anionic surfactants decyltriethylammonium bromide–sodium decyl sulfonate. Colloids Surf B: Biointerfaces, 2005, 41(2/3):139?143.

[10] Goh KM, Mahadi NM, Hassan O, et al. Molecular modeling of a predominant β-CGTase G1 and analysis of ionic interaction in CGTase. Biotechnology, 2008, 7(3):418?429.

[11] Lú-Chau TA, Ruiz-Due?as FJ, Camarero S, et al. Effect of pH on the stability of Pleurotus eryngii versatile peroxidase during heterologous production in Emericella nidulans.Bioprocess Biosyst Eng, 2004, 26(5): 287?293.

[12] Li ZF, Zhang JY, Wang M, et al. Mutations at subsite-3 in cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus macerans enhancing α-cyclodextrin specificity. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 83: 483?490.

[13] Hlady V, Buijs J. Protein adsorption on solid surfaces.Curr Opin Biotechnol, 1996, 7(1): 72?77.

[14] Kaushik JK, Bhat R. Thermal stability of proteins in aqueous polyol solutions: role of the surface tension of water in the stabilizing effect of polyols. J Phys Chem B,1998, 102(36): 7058?7066.

[15] Lerbret A, Bordat P, Affouard F, et al. How do trehalose,maltose and sucrose influence some structural and dynamical properties of lysozyme? Insight from molecular dynamics simulations. J Physical Chem B, 2007, 111(31):9410?9420.

[16] Gekko K, Timasheff SN. Mechanism of protein stabilization by glycerol: preferential hydration in glycerol-water mixtures. Biochemistry, 1981, 20(16):4667?4676.

[17] Wang AP, Dong SW, Lu DN. Study on thermal stabilizer of α-amylase and its inactivation kinetic. Textile Auxiliaries, 2009, 26(3): 10?13.

王愛平, 董紹偉, 陸大年. α-淀粉酶熱穩(wěn)定劑及失活動(dòng)力學(xué)研究. 印染助劑, 2009, 26(3): 10?13.

[18] Nielsen AD, Pusey ML, Fuglsang CC, et al. A proposed mechanism for the thermal denaturation of a recombinant Bacillus halmapalus alpha-amylase--the effect of calcium ions. Biochim Biophys Acta, 2003, 1652(1): 52?63.

[19] Wang YB, Nagata S. Participation of ions and solutes on the thermostability of α-amylase. Chin J Biotech, 2004,20(1): 104?110.

王耀兵, 永田進(jìn)一. 無(wú)機(jī)離子和有機(jī)溶質(zhì)對(duì) α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2004, 20(1): 104?110.

[20] Mao XH, Li X, Wang SS, et al. Stabilizers of horseradish peroxidase. Chin J Biotech, 2009, 25(3): 388?391.

毛新煥, 李響, 王姍姍, 等. 辣根過氧化物酶的熱穩(wěn)定劑. 生物工程學(xué)報(bào), 2009, 25(3): 388?391.

[21] Watanabe K, Fujita Y, Usami M, et al. Thermodynamic analysis of Bacillus cereus oligo-1,6-glucosidase and its cumulatively praline-introduced mutant proteins by differential scanning calorimetry. J Mol Catal B: Enzym,2000, 10(1/3): 257?262.

[22] Arakawa T, Timasheff SN. Mechanism of polyethylene glycol interaction with proteins. Biochemistry, 1985,24(24): 6756?6762.

[23] Greenfield NJ, Fasman GD. Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation.Biochemistry, 1969, 8(10): 4108?4116.

[24] Citovsky V, Yanai P, Loyter A. The use of circular dichroism to study conformational changes induced in Sendai virus envelope glycoproteins. Acorrelation with the viral fusogenic activity. J Biol Chem, 1986, 261(5):2235?2239.

[25] Lu RC, Cao AN, Lai LH, et al. Effect of cationic surfactants on the interaction between sodium perfluorooctanoate and β-lactoglobulin. J Colloid Interface Sci, 2006, 293(1):61?68.

[26] Shen Q, Huang B, Shao JL, et al. Mechanism discussion of interaction between enzyme and several compounds with circular dichroism method. J Sun Yatsen Univ, 2006,45(4): 62?64.

沈瓊, 黃濱, 邵嘉亮, 等. 運(yùn)用圓二色譜研究酶與化合物相互作用的機(jī)理. 中山大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 45(4): 62?64.

[27] Andrade MA, Chacón P, Merelo JJ, et al. Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism spectra using an unsupervised learning neural network. Protein Eng, 1993, 6(4): 383?390.

[28] Lu RC, Cao AN, Lai LH, et al. Protein-surfactant interaction: differences between fluorinated and hydrogenated surfactants. Colloids Surfaces B:Biointerfaces, 2008, 64(1): 98?103.

[29] Bischof JC, He XM. Thermal stability of proteins. Ann N Y Acad Sci, 2006, 1066: 12?33.

Enhanced storage stability of recombinant enzyme preparation of α-CGTase from Paenibacillus macerans by chemical additives

Xianliang Zheng1,2, Dan Wu1,2, Zhaofeng Li1,2, Jian Chen1,2, and Jing Wu1,2

1 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

2 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

Received: May 26, 2010; Accepted: August 18, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81025018).

Corresponding author: Wei Chen. Tel/Fax: +86-10-63815273; E-mail: chenwei0226@yahoo.com.cn國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81025018) 資助。