寡糖特異性麥芽糖酶產生菌的產酶條件優化

劉 賽 男, 顧 艷 麗, 張 慧, 李 憲 臻

(大連工業大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

麥芽糖是重要的淀粉糖品種,在人體代謝中不需胰島素就能被吸收[1]。純麥芽糖可用于糖尿病患者靜脈輸液,是糖尿病患者的營養劑和輔助治療劑,所以高純度的麥芽糖在醫藥上具有重要的價值[2]。目前的麥芽糖生產是將淀粉通過真菌淀粉酶和β-淀粉酶處理[3],產生由葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、四糖等麥芽低聚糖以及多糖組成的普通麥芽糖漿[4]。要得到高麥芽糖漿,還要再添加脫支酶和β-淀粉酶共同作用,或用葡萄糖淀粉酶等對普通麥芽糖漿進行后處理[5]。由于后處理所添加的酶都能水解麥芽糖,造成原料的浪費,并且難以獲得高產率的純麥芽糖[6-9]。

寡糖特異性麥芽糖酶可以作用于麥芽三糖、四糖等麥芽糖低聚糖生成葡萄糖和麥芽糖,從而提高麥芽糖的含量和純度[10]。本研究以分離到的一株能夠降解麥芽低聚糖的寡糖特異性麥芽糖酶產生菌M136為對象,并以實驗室自制麥芽低聚糖作為酶解底物對菌種的產酶條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 微生物菌株

寡糖特異性麥芽糖酶生產菌M136,本實驗室分離保存。

1.2 培養基

固體培養基：普通麥芽糖漿20 g/L,酵母浸粉1.0 g/L,瓊脂20 g/L。

基礎培養基：普通麥芽糖漿/麥芽低聚糖漿(實驗室自制)20 g/L,酵母浸粉1.0 g/L。

1.3 酶活力分析方法

以自制麥芽低聚糖(500 g/L)作為酶解底物,將0.96 mL粗酶液與40 μL麥芽低聚糖混合后,在37 ℃水浴中反應1 h,用DNS法測定還原糖。

酶活力單位定義：每小時催化麥芽低聚糖降解生成1 mg還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。

1.4 產酶條件優化

分別調整菌體生長時間、溫度、基礎培養基初始pH、碳源的種類和質量濃度以及氮源的種類和質量濃度,在轉速為150 r/min的搖床培養24 h。9 000 r/min離心后取上清液為粗酶液,測定酶活力并比較以確定最佳產酶條件。

2 結果與討論

2.1 培養基初始pH對產酶的影響

將基礎培養基的初始pH分別調至4.0～10.0進行發酵培養24 h,觀察pH對產酶的影響,結果見圖1。pH在6.0～7.5產酶相對較高,在pH為6.5時產酶最高。可以在較廣的pH范圍內保持一定的產酶量。

圖1 培養基初始pH對產酶的影響

2.2 碳源種類對產酶的影響

分別在培養基中加入葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽低聚糖、糊精、可溶性淀粉和纖維糊精等碳源,考察碳源對產酶的影響,結果如圖2所示。作為碳源,單糖和二糖不如低聚糖和多糖效果好,而由不含單糖和多糖的麥芽低聚糖作為碳源更能提高產酶,可能存在一定誘導作用。

2.3 碳源濃度對產酶的影響

以麥芽低聚糖作為碳源,調整碳源的質量濃度依次為10、20、30、40、50和60 g/L,對菌種進行發酵培養24 h,觀察不同碳源濃度對產酶的影響。結果如圖3所示。隨著碳源濃度升高,酶產量也升高,50 g/L時達到最高,碳源的質量濃度高于50 g/L,對產酶具有一定的抑制作用。

圖2 碳源對產酶的影響

Fig.2 Effect of carbon source on production of maltogenase

圖3 碳源的質量濃度對產酶的影響

Fig.3 Effect of concentration of carbon source on production of maltogenase

2.4 氮源種類對產酶的影響

以麥芽低聚糖作為碳源,分別加入蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、牛肉膏、硝酸銨和尿素等氮源,觀察不同氮源對產酶的影響,結果如圖4所示。無機氮源不利于產酶,有機氮源較適合產酶,其中酵母浸粉為最佳氮源。

圖4 氮源對產酶的影響

Fig.4 Effect of nitrogen source on production of maltogenase

2.5 氮源濃度對產酶的影響

以酵母浸粉作為氮源,調整氮源的質量濃度依次為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L,對菌種進行發酵培養24 h,觀察氮源質量濃度對產酶的影響,結果如圖5所示。隨著氮源濃度升高,酶產量也升高,2.0 g/L時達到最高,碳源的質量濃度高于2.0 g/L時,對產酶具有一定的抑制作用。

圖5 氮源的質量濃度對產酶的影響

Fig.5 Effect of concentration of nitrogen source on production of maltogenase

2.6 溫度對產酶的影響

選擇20、28、37、45和50 ℃作為培養溫度,觀察菌體在不同溫度下培養24 h的產酶情況,結果見圖6。在37 ℃時,寡糖特異性麥芽糖酶的產量最高,溫度過高和過低對產酶都有影響。

圖6 溫度對產酶的影響

Fig.6 Effect of temperature on production of maltogenase

3 結 論

實驗結果表明,M136菌能夠生產寡糖特異性麥芽糖酶,該酶具有將麥芽低聚糖降解并生成葡萄糖和麥芽糖的能力,該菌株可以在較廣的pH范圍內保持一定的產酶量。以單糖和二糖作碳源不如低聚糖和多糖的效果好,而由不含單糖和多糖的麥芽低聚糖作為碳源更能提高產酶,存在一定誘導作用。隨著碳源濃度升高,酶產量也升高,而過高的碳源濃度對產酶反而具有一定的抑制作用。無機氮源不利于產酶,有機氮源較適合產酶。隨著氮源濃度升高,酶產量也升高,碳源濃度過高對產酶具有一定的抑制作用。在37 ℃時,寡糖特異性麥芽糖酶的產量最高,溫度過高和過低對產酶都有影響。綜上所述,該菌株最佳產酶條件為：以麥芽低聚糖作為碳源,碳源的質量濃度為50 g/L,以酵母浸粉作為氮源,氮源的質量濃度為2 g/L,發酵時間為24 h,溫度為37 ℃,培養基初始pH為6.5。

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