牡蠣脂質的超臨界CO2萃取及氣相色譜-質譜分析

佟 蕾, 朱 蓓 薇, 周 大 勇, 秦 磊, 遲 雅 麗

(1.大連工業大學 海洋食品教育部工程研究中心, 遼寧 大連 116034;2.大連工業大學 農業部農產品加工技術研發貝類專業分中心, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

牡蠣是一種世界性的海產經濟貝類。牡蠣的收獲季節比較集中,生鮮牡蠣易變質腐敗,長期保存和遠程運輸都有一定的困難,因此,對牡蠣進行深加工,延長產品的貯藏期,提高產品的附加值,意義重大。目前牡蠣的研究多集中在牡蠣肽[1]、牡蠣牛磺酸[1]、牡蠣糖原[2]及牡蠣調味料[3]等。研究表明,脂質占牡蠣肉干重的6%～14%[4-6],其脂肪酸組成中多不飽和脂肪酸占40%以上[4,7],并以高含量的EPA和DHA為特征[4]。當前,在牡蠣精深加工中主要回收水溶性成分,而對牡蠣脂質并沒有進行利用,造成嚴重的資源浪費。因此,建立合適的牡蠣脂質回收方法非常必要。關于采用超臨界CO2萃取法提取牡蠣脂質的方法尚未見報道。本文旨在采用超臨界CO2萃取法提取牡蠣脂質,以期尋找一種制備牡蠣脂質的綠色途徑。此外,超臨界CO2萃取脂質處理過程不會造成物料中蛋白質的變性[8],提取脂質后剩余殘渣仍可作為原料制備水溶性深加工產品,以實現資源的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

脂肪酸標準品(37 Component FAME Mix)購于Sigma公司；其他試劑均為國產分析純或色譜純。

LG-1.0型真空冷凍干燥機,沈陽新陽速凍設備制造有限公司；HA121-50-01C超臨界萃取裝置,江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；Agilent 6890N GC- 5973 MSD氣質聯用儀,美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

新鮮大連灣牡蠣(Crassostreatalienwhanensis)于2009年4月購于大連長興水產市場,原料去殼后,洗掉附著的泥沙和鹽分,瀝干水分,冷凍干燥后粉碎至20目,存于-20 ℃備用。

1.2.2 牡蠣凍干粉化學組成分析

水分含量測定：AOAC(1990)標準方法952.08[9]；

粗蛋白含量測定：AOAC(1990)標準方法981.10[9],N×6.25；

總糖含量測定：苯酚硫酸法(以葡萄糖為標準)[10]；

粗脂肪含量測定：索氏提取法[11]。

1.3 牡蠣脂質的提取

1.3.1 超臨界CO2萃取法

稱取50 g牡蠣凍干粉末置于超臨界裝置的萃取釜中,升壓升溫后進行萃取,萃取條件參照文獻[12]：萃取壓力28 MPa,萃取溫度50 ℃,CO2體積流量20 L/h,萃取時間80 min。萃取完成后,將所收集脂質稱重,存于-20 ℃備用。

1.3.2 不可皂化物(甾醇)的提取

不可皂化物的提取方法參照文獻[13-14]。將100 mg脂質樣品置于四氟乙烯墊片旋蓋小瓶中,加入2.5 mL質量濃度為0.5 g/mL氫氧化鉀溶液和5 mL 95%的乙醇溶液。混勻后擰緊瓶蓋,60 ℃水浴加熱2 h,加熱過程中不斷攪動。皂化完成后,在冷水中迅速冷卻至室溫。使用正己烷萃取不可皂化物,每次加入4 mL,萃取6次。將正己烷合并后用去離子水洗至中性,35 ℃下氮吹至恒重,稱重后存于-20 ℃備用。

1.3.3 脂肪酸的提取及甲酯化

脂肪酸的提取及甲酯化方法參照文獻[13-14]。將上述萃取不可皂化物后剩下溶液用6 mol/L鹽酸調至pH 1.0以下。冷卻至室溫后用正己烷萃取可皂化物,每次加入4 mL,萃取6次。將正己烷合并后用去離子水洗至中性,35 ℃下氮吹至恒重,并稱重。取適量不可皂化物溶于正己烷中,使其質量濃度為10 mg/mL。取2 mL不可皂化物溶液置于四氟乙烯墊片旋蓋小瓶中,并向小瓶中加入2 mL新配制的甲基化試劑(含1%硫酸的色譜級甲醇),70 ℃水浴加熱1 h。反應完成后冷卻至室溫,加入1 mL去離子水,取出含有脂肪酸甲酯的正己烷層存于-20 ℃備用。

1.3.4 GC-MS分析

不可皂化物和脂肪酸甲酯均使用Agilent 6890N GC-5973 MSD氣質聯用儀進行分析。色譜柱：HP-5-MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),使用氦氣為載氣,恒壓0.11 MPa(16.09 psi)。脂肪酸甲酯分析條件：初始溫度140 ℃,保持5 min；以2.5 ℃/min速度升至250 ℃,保持10 min；以50 ℃/min的速度升至300 ℃,保持10 min。不可皂化物分析條件：初始溫度200 ℃,保持5 min；以5 ℃/min速度升至320 ℃,保持10 min。質譜分析采用EI源(70 eV),選取Scan模式,掃描范圍m/z50～550,溶劑延遲4 min。在脂肪酸的分析中,根據GC-MS中各組分保留時間以及質譜圖,通過脂肪酸標準品(37 Component FAME Mix)和NIST02庫檢索進行鑒定,用峰面積歸一法計算各脂肪酸的組成。在甾醇的分析中,根據GC-MS各組分的質譜圖,通過NIST02庫檢索進行鑒定,用峰面積歸一法計算各甾醇的組成。

2 結果與分析

2.1 牡蠣干粉的主要營養成分

新鮮牡蠣中,貝殼可占總質量的80%～85%,貝肉占10%～20%,殼內海水占5%～8%[15]。海洋貝類的營養組成受棲居地、食物及采收季節的影響很大[16]。從表1所測定的牡蠣肉凍干粉的主要營養組成來看,含有36.8%的總糖和47.3%的蛋白質,脂肪為9.2%,此結果與課題組之前所測定的一月份采收的同種屬牡蠣的營養組成略有差別[6]。牡蠣干粉中含有9.2%的總脂,表明其可作為提取脂質的原料。

表1 牡蠣干粉的營養成分(干重)

Tab.1 Content of nutritive constituents in oyster meat (on dry basis)

成分粗脂肪粗蛋白總糖水分w/%9.247.336.82.4

2.2 超臨界CO2萃取法提取牡蠣脂質的回收率

本實驗采用的提油條件是課題組前期研究超臨界CO2萃取法提取扇貝內臟脂質最優條件[12]。采用“1.3.1”所示方法提取牡蠣脂質的回收率為68.48%,說明此方法適用于牡蠣脂質的提取。

2.3 牡蠣脂質的脂肪酸組成

多不飽和脂肪酸是指含有兩個或兩個以上雙鍵的脂肪酸。花生四烯酸、EPA、DHA等都是人體不可缺少而自身又不能合成的必需脂肪酸,在人體內具有廣泛的生理功能和生物學效應[17]。牡蠣脂質中脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖見圖1,牡蠣脂質的脂肪酸組成分析結果見表2。本研究所提取的牡蠣脂質中,花生四烯酸(C20:4n-6)、EPA(C20:5n-3)、DHA(C22:6n-3)等多不飽和脂肪酸含量較高,可占總脂肪酸的34.6%,這也與文獻[4-5]報道的結果相符,說明牡蠣脂質具有很高的開發和利用價值。

圖1 脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖

Fig.1 The total ion chromatography of fatty acid methyl esters

2.4 牡蠣脂質的甾醇組成

甾醇類(sterols)化合物在自然界中廣泛分布,固態時又稱固醇,是以環戊烷全氫菲為骨架(又稱甾核)的一種化合物。牡蠣中甾醇的總離子流色譜圖見圖2,牡蠣脂質中甾醇組成分析結果見表3。由表3可知,經超臨界CO2萃取法提取的牡蠣脂質的不可皂化物主要由甾醇類化合物組成,其膽甾醇質量分數較高(接近40%),還含有較多的麥角甾醇衍生物、豆甾醇衍生物以及巖藻甾醇。牡蠣甾醇中膽固醇相對含量較低,說明其是一種健康脂質。麥角甾醇主要分布在菌類中,豆甾醇主要分布在植物中,而巖藻甾醇主要分布在藻類中,牡蠣脂質中含有的這些甾醇可能來源于其攝入的食物。軟體動物一般不能自行合成甾醇,其體內的甾醇都是通過食物攝取的[18]。

表2 超臨界CO2萃取牡蠣脂質中脂肪酸組成分析

Tab.2 Fatty acids compositions (%) of lipids extracted by SC-CO2method

脂肪酸w/%C14:02.6C16:1n-76.3C16:022.5C17:00.7C18:2n-63.0C18:1n-910.3C18:1n-77.8C18:03.7C20:4n-61.7C20:5n-320.4C20:2n-70.3C20:1n-93.0C20:1n-72.6C22:6n-39.1未鑒定5.9飽和脂肪酸29.4單不飽和脂肪30.1多不飽和脂肪酸34.6

圖2 甾醇的總離子流色譜圖

表3 超臨界CO2萃取牡蠣脂質中甾醇組成分析

Tab.3 Sterols compositions (%) of lipids extracted by SC-CO2methods

甾醇w/%(22Z)-26,27-二降-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇1.9膽甾-5,22-二烯-3β-醇4.4膽甾醇39.4膽甾烷醇4.9(22E,24S)-麥角甾-5,22-二烯-3β-醇16.1麥角甾-5,24-二烯-3β-醇13.3豆甾醇0.922,23-二氫-豆甾醇12.2豆甾烷醇0.7巖藻甾醇6.4

傳統的提取脂質(有機溶劑萃取)過程中,大部分的有機溶劑都可以回收再利用,但是此過程仍然會不可避免的排放少量有機溶劑。與傳統的有機溶劑萃取法相比,超臨界CO2萃取法雖然在提取效率上相對較低,但由于其提取過程不用有機溶劑,可以防止提取產品中對人體有害溶媒的殘留和對環境的污染。此外,由于超臨界CO2萃取溫度相對較低,不會造成提取原料中的蛋白質變性[8],提取的剩余殘渣還可以繼續加以利用,也值得更進一步的研究。

3 結 論

(1)采用超臨界CO2萃取法制備牡蠣脂質,其回收率為68.48%。

(2)超臨界CO2萃取法制備的牡蠣脂質的EPA和DHA含量高,分別占總脂肪酸的20.4%和9.1%；膽固醇含量低,占甾醇的39.4%,有一定的開發利用價值。

[1] 葉盛權. 牡蠣產品的開發研究[J]. 食品研究與開發, 2003, 24(6):83-85.

[2] 李青選. 牡蠣保健食品及國外開發的概況[J]. 中國海洋藥物, 1989(2):47-52.

[3] 吳永沛. 酶法加工牡蠣調味品的研究[J]. 廈門水產學院學報, 1989, 11(1):52-58.

[4] ANNE L P, CAROLE P, JOEL H, et al. Comparison of two microalgal diets. 1. Influence on the biochemical and fatty acid compositions of raw oysters (Crassostreagigas)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(7):2006-2010.

[5] SALWA D, MOHAMD S R, M’HAMED E. Seasonal variation in weight and biochemical composition of the Pacific oyster, Crassostrea gigas in relation to the gametogenic cycle and environmental conditions of the Bizert lagoon, Tunisia [J]. Aquaculture, 2007, 263:238-248.

[6] DONG Xiu-ping, ZHU Bei-wei, ZHAO Hong-xia, et al. Preparation and in vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates from oyster (Crassostreatalienwhannensis) meat[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2010, 45(5):978-984.

[7] PEDNEAUIT K, ANGERS P, AVIS T J, et al. Fatty acid profiles of polar and non-polar lipids of Pleurotus ostreatus and P. cornucopiae var. ‘citrino-pileatus’ grown at different temperatures[J]. Mycological Research, 2007, 111(10):1228-1234.

[8] WANG S S S, CHAO H S, LIU H L, et al. Stability of hen egg white lysozyme during denaturation is enhanced by pretreatment with supercritical carbon dioxide[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2009, 107(4): 355-359.

[9] HORWITZ W. Official methods of Analysis of the association of official analytical chemists[S]. 15thEd. Association of Official Analytical Chemists.Virginia:Arlington, 1990.

[10] DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances [J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3):350-356.

[11] 寧正祥. 食品成分分析手冊 [M]. 北京:中國輕工業出版社, 1998:163-165.

[12] 馬媛,王璐,孫玉梅,等. 超臨界萃取法提取扇貝內臟脂質的研究[J]. 食品與發酵工業, 2006, 32(9):156-159.

[13] JEONG W S, LACHANCE P A. Phytosterols and fatty acids in fig (Ficuscarica, var. Mission) fruit and tree components [J]. Journal of Food Science, 2001, 66(2):278-281.

[14] KOVACS M I P, ANDERSON W E, ACKMAN R G. A simple method for the determination of cholesterol and some plant sterols in fishery-based food products[J]. Journal of Food Science, 1979, 44(5):1299-1301.

[15] 滕瑜,王彩理. 牡蠣的營養和降糖作用研究[J]. 海洋水產研究, 2005, 26(6):39-44.

[16] 黎輝,何慧,金啟增. 大亞灣三種經濟貝類的營養生態位及潛在產量評估[J]. 熱帶海洋, 1999, 18(4):53-59.

[17] 王鏡巖,朱圣庚,徐長法. 生物化學:上冊[M]. 3版. 北京:高等教育出版社, 2002:82, 88.

[18] MATTHEL M N, DAVID L L, CHARLES F P, et al. Comparison of growth and lipid composition in the green abalone, Haliotis fulgens, provided specific macroalgal diets[J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 2002, 131:695-712.