刺參體壁膠原蛋白的檢測條件

趙 興 坤, 朱 蓓 薇, 董 秀 萍, 周 大 勇, 楊 靜 峰, 秦 磊, 劉 海 英

(1.大連工業大學 海洋食品教育部工程研究中心, 遼寧 大連 116034;2.大連工業大學 農業部農產品加工技術研發貝類專業分中心, 遼寧 大連 116034;3.時代海洋食品(大連)有限公司, 遼寧 大連 116044)

0 引 言

膠原蛋白是動物結締組織,如皮、腱、韌帶、軟骨等的主要蛋白成分,廣泛應用于醫藥、化妝品、食品、飼料等工業中。不同來源的膠原具有不同的化學組成和結構。膠原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等,其中羥脯氨酸和羥賴氨酸在其他蛋白中很少見,為膠原蛋白所特有。通過對羥脯氨酸的檢測可以較準確地反映膠原蛋白的含量情況,但是在測定羥脯氨酸前需對膠原蛋白進行酸水解。傳統的酸水解方法是在110 ℃使用6 mol/L的鹽酸水解24 h,此方法水解時間較長,同時,由于水解時間不同會導致膠原蛋白水解片段(肽鏈)長度不同,羥脯氨酸的測定值也會隨之產生變化[1],因而,傳統方法很難準確反映不同來源膠原蛋白中羥脯氨酸的含量。

刺參(Stichopusjaponicus)體壁主要由蛋白質組成,而刺參體壁蛋白中約有70%是膠原蛋白。膠原蛋白的質量分數可以通過測定其中羥脯氨酸的質量分數來間接確定,為了簡化刺參體壁膠原蛋白質量分數檢測的操作,本研究計劃對刺參體壁酶促溶性膠原蛋白(pepsin-solubilized collagen,PSC)和酸溶性膠原蛋白(acid-soluble collagen,ASC)的水解條件分別進行優化,并對PSC和ASC中羥脯氨酸質量分數進行測定。

1 材料和方法

1.1 材 料

新鮮刺參(Stichopusjaponicus),產地為大連海洋島。

氯胺T晶體,分析純,天津傲然精細化工研究所；高氯酸,分析純,天津市新亞化工廠；對二甲氨基苯甲醛,分析純,天津市化學試劑研究所；羥脯氨酸,Sigma。

UV-2100型紫外可見分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司；PH070A型培養箱/干燥箱,上海一恒科技有限公司。

1.2 試劑的配制

1.2.1 緩沖液

取檸檬酸5.0 g、醋酸1.2 mL、醋酸鈉12.0 g、氫氧化鈉3.4 g,混合后定容至100 mL,pH為6.0,冷藏保存。

1.2.2 氯胺T溶液

準確稱取氯胺T 1.4 g,加入蒸餾水20 mL,異丙醇30 mL和緩沖液50 mL,混合均勻。

1.2.3 高氯酸溶液

量取高氯酸27 mL,加水定容至100 mL。

1.2.4 對二甲氨基苯甲醛溶液

稱取對二甲氨基苯甲醛2 g,加入60%高氯酸7 mL,異丙醇13 mL,混勻后冷藏保存。

1.3 方 法

1.3.1 刺參酶促溶性膠原蛋白和酸溶性膠原蛋白的提取

刺參體壁膠原纖維的提取方法在文獻[2-5]基礎上稍做修改。稱取50 g體壁切成碎塊,加入適量的去離子水,打漿,水洗2次,鹽洗過夜,水洗至中性,堿洗3 d,水洗至中性得粗膠原纖維。

將粗膠原纖維用乙酸進行酸提,用NaCl進行鹽析,用10倍體積乙酸透析12 h,每4 h換1次透析液,再用去離子水透析至中性,凍干得酸溶性膠原蛋白。

酸提后的不溶物,用去離子水沖洗,放在2倍體積乙酸中,加入胃蛋白酶,緩慢攪拌3 d,加入NaCl鹽析,于10倍體積NaH2PO3中透析24 h,每4 h換1次透析液,再用去離子水透析至中性,凍干得酶促溶性膠原蛋白。

1.3.2 刺參體壁酶促溶性膠原蛋白和酸溶性膠原蛋白中羥脯氨酸質量分數的測定

取待測膠原蛋白樣品7 mg于安醅瓶中,加入3 mL 6 mol/L鹽酸溶液,酒精噴燈封口。封口的安醅瓶置于烘箱中保溫一定時間后,將水解液移至小燒杯中,滴入1滴甲基紅試劑,然后加入2 mol/L NaOH中和至pH 6.5～7.0,定容至50 mL。取定容后溶液1 mL,加入1 mL檸檬酸緩沖液和1 mL氯胺T溶液在室溫(25 ℃)氧化10 min,加入27%高氯酸1 mL放置10 min,加入對二甲基氨基苯甲醛1 mL,振蕩,65 ℃水浴顯色20 min,立即冷卻后在560 nm處測其吸光度,吸光值越大表示羥脯氨酸質量分數越高。

1.3.3 標準曲線的制作

分別吸取不同濃度羥脯氨酸標準溶液1 mL(溶于0.01 mol/L鹽酸),加入1 mL檸檬酸緩沖液和1 mL氯胺T溶液在室溫(25 ℃)氧化10 min,加入27%高氯酸1 mL放置10 min,加入對二甲基氨基苯甲醛1 mL,振蕩,65 ℃水浴顯色20 min,立即冷卻后在560 nm處測吸光度。以羥脯氨酸的質量分數為橫坐標,吸光值為縱坐標制作羥脯氨酸標準曲線如圖1所示。羥脯氨酸的標準曲線的回歸方程為y=0.059x-0.003,歸一化系數R2=0.999 3。

圖1 羥脯氨酸標準曲線

1.3.4 水解條件的優化

酶促溶性膠原蛋白和酸溶性膠原蛋白在110、115、120、125和130 ℃ 5個溫度下,分別水解2～30 h,時間間隔為2 h,選取所測羥脯氨酸的質量分數最高的條件為最佳水解條件。

2 結果與討論

2.1 刺參體壁PSC和ASC最佳水解條件的確定

羥脯氨酸的吸光值隨時間的變化如圖2所示。由圖2可知,在110、115、120、125和130 ℃的水解溫度下,PSC分別水解12、10、6、6和4 h時羥脯氨酸的吸光值最高。在不同水解溫度的最佳水解時間條件下,羥脯氨酸的吸光值的變化如圖3所示。可以看出,PSC在120 ℃水解6 h時,所測得羥脯氨酸的吸光值最高,說明此水解條件能充分釋放膠原蛋白中所含有的羥脯氨酸,因此PSC的最佳水解條件確定為溫度120 ℃,時間6 h。

圖2 PSC在不同水解溫度下的羥脯氨酸的吸光值隨水解時間變化趨勢

圖3 PSC在不同水解溫度的最佳水解時間下的羥脯氨酸的吸光值變化

Fig.3 Hydroxyproline contents of PSC hydrolyzed at different temperature and time

由圖4可知,ASC在110、115、120、125和130 ℃水解時,相應水解時間分別為14、10、6、6和4 h時羥脯氨酸的吸光值最高。在不同水解溫度的最佳水解時間條件下,羥脯氨酸的吸光值的變化如圖5所示。可以看出,ASC在 120 ℃水解時,所測得羥脯氨酸的吸光值最高,說明此水解條件能充分釋放膠原蛋白中所含有的羥脯氨酸,因此ASC最佳水解條件也確定為溫度120 ℃,時間6 h。

由圖2、4分析可知,膠原蛋白在不同的水解溫度均存在一個最佳水解時間,在同一溫度水解時,羥脯氨酸的吸光值的變化趨勢是先上升后下降,水解20 h以后,所測得羥脯氨酸的吸光值趨于平穩,上下波動幅度不大。這是由于膠原蛋白在水解初期,羥脯氨酸逐漸釋放出來,待膠原蛋白完全水解,充分釋放羥脯氨酸后,游離的羥脯氨酸會隨著水解時間延長而逐漸分解,導致所測得羥脯氨酸的吸光值下降,但最終會趨于平穩,這可能是由于引起羥脯氨酸分解的化學反應趨于平衡所致。

2.2 刺參體壁PSC和ASC中羥脯氨酸的質量分數的測定

由圖3和圖5分析可知,刺參體壁中酶促溶性膠原蛋白和酸溶性膠原蛋白的最佳水解條件均為溫度120 ℃,時間6 h。在最佳水解條件下,可測得酶促溶性膠原蛋白中羥脯氨酸的質量分數為8.29%,酸溶性膠原蛋白中羥脯氨酸的質量分數為8.16%。此結果與文獻所報道過的海參(Cucumariafrondosa)羥脯氨酸的質量分數占其膠原蛋白7.7%[6]的結論相接近。

圖4 ASC在不同水解溫度下的羥脯氨酸的吸光值隨水解時間變化趨勢

圖5 ASC在不同水解溫度的最佳水解時間下的羥脯氨酸的吸光值變化

Fig.5 Hydroxyproline contents of ASC hydrolyzed at different temperature and time

3 結 論

刺參體壁酶促溶性膠原蛋白和酸溶性膠原蛋白的最佳水解條件均為溫度120 ℃,時間6 h。

通過對刺參體壁膠原蛋白水解條件進行優化,有利于準確測定刺參體壁中膠原蛋白的質量分數,縮短水解時間,簡化實驗操作。

刺參體壁酶促溶性膠原蛋白中羥脯氨酸的質量分數為8.29%,酸溶性膠原蛋白中羥脯氨酸的質量分數為8.16%。

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