麥冬皂苷D的分離提純

鄧 惠 方, 王 東 明, 富 瑤 瑤, 胡 雪 蓮, 魚 紅 閃, 金 鳳 燮

(大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034)

0 引 言

麥冬有效成分主要是麥冬多糖和甾醇類皂苷,具有多種藥理功能和較好的藥用價(jià)值[1]。國內(nèi)外學(xué)者從上世紀(jì)六、七十年代開始對皂苷類成分進(jìn)行研究[2-3],先后從麥冬類植物中分離出數(shù)十種皂苷,其中具有代表性的麥冬皂苷D(ophiopogonin D),在川麥冬中含量較高[4],可作為川麥冬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。麥冬總皂苷提取的常規(guī)方法為水提法(即蒸煮法)、醇提法和酶提法[5]。車仁國等[9]對麥冬總皂苷的不同提取方法進(jìn)行了比較研究。本文在此基礎(chǔ)上采用醇提法以甲醇作為浸提液,提取麥冬總皂苷,經(jīng)過脫色、脫脂處理,硅膠柱層析分離和高效液相色譜法相結(jié)合,得到純度較高的麥冬皂苷D,滿足常規(guī)分析檢測對標(biāo)準(zhǔn)品的要求。

1 材料與方法

1.1 材 料

麥冬,市售,四川產(chǎn)；麥冬皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品,上海尚誼化工科技有限公司；薄層層析板Silica Gel 60-F254,德國Merck公司；硅膠,青島海洋化工廠；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 麥冬總皂苷的提取

稱取10 kg麥冬,粉碎后用3倍體積甲醇浸泡3次,每次2 d,濃縮,用皂苷溶液1/3體積的石油醚脫脂后,再用皂苷溶液1/3體積的水飽和正丁醇萃取3次,合并正丁醇層。水洗正丁醇層脫糖,最后將正丁醇層濃縮、干燥、收集、稱重,得麥冬總皂苷。取少量干燥樣品溶于甲醇進(jìn)行TLC檢測。

1.2.2 硅膠柱層析法分離純化樣品

制備樣品膠:將麥冬總皂苷用少量的氯仿和甲醇溶解,加入待分離樣品質(zhì)量2.5倍的80～100目硅膠,水浴蒸干,不斷攪拌,直至硅膠復(fù)為粉末狀。

裝柱:取300～400目硅膠作分離膠,在玻璃柱內(nèi)鋪放均勻后,裝入樣品膠,最上層置脫脂棉。

洗脫:先用氯仿通柱,然后分別按照體積比V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶0.5、8∶2,V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5的梯度進(jìn)行洗脫,TLC檢測分離結(jié)果,最后收集麥冬皂苷D洗脫液,濃縮,蒸干得固體粉末。

1.2.3 薄層層析法(TLC)檢測樣品中皂苷成分

將1 mg麥冬皂苷溶于1 mL甲醇,微量點(diǎn)樣器吸取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品,點(diǎn)樣于薄層層析板,然后置于層析缸中展開,展開劑體積比為V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5,用10%硫酸溶液加熱顯色。通過對照樣品斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品斑點(diǎn)來確定樣品中所含有的麥冬皂苷D。

1.2.4 高效液相色譜法(HPLC)測定純度

色譜儀,Waters 2695高效液相色譜分析儀,Waters 2996二極管陣列檢測器及Empower色譜工作站對總皂苷進(jìn)行檢測。色譜條件:色譜柱,Kromasil (5 μm,250 mm×4.6 mm)；柱溫,35 ℃；進(jìn)樣量,10 μL；體積流量,1.0 mL/min；檢測波長,199 nm。將待測人參皂苷樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用色譜甲醇溶解,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,即為檢測樣品,樣品及標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。流動相,乙腈(A)-水(B)。初始時(shí),φ(A)=30%,φ(B)=70%；20 min時(shí),φ(A)=50%,φ(B)=50%；40 min時(shí),φ(A)=90%,φ(B)=10%。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥冬總皂苷的提取

采用甲醇浸提法按方法“1.2.1”提取麥冬總皂苷。將10 kg麥冬經(jīng)甲醇浸泡提取,石油醚脫脂,正丁醇萃取,水洗脫糖后干燥稱重,得到麥冬總皂苷粉末18.1 g,提取率為0.181%。取少量干燥樣品,溶于甲醇中進(jìn)行TLC檢測,檢測結(jié)果如圖1所示。由圖1可知麥冬總皂苷中含有麥冬皂苷D。

標(biāo),麥冬皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品；1,麥冬總皂苷

2.2 麥冬皂苷的硅膠分離

將提取的18 g麥冬總皂苷,制成45 g樣品膠,取300～400目硅膠360 g作為分離膠,按方法“1.2.2”進(jìn)行分離,洗脫液分瓶收集,每瓶體積為200 mL,標(biāo)號依次為1,2,3……分瓶取樣。為了獲得更多且純度較高的麥冬皂苷D樣品,用一個(gè)梯度洗脫同時(shí)用薄層層析跟蹤檢測,當(dāng)薄層層析板上出現(xiàn)下個(gè)斑點(diǎn)時(shí),更換極性大的梯度繼續(xù)洗脫,共收集洗脫液83瓶,TLC檢測結(jié)果如圖2所示。 從圖2可以看出,從44瓶開始有麥冬皂苷D樣品洗出直到74瓶,但是第73瓶以后拖尾嚴(yán)重,說明有其他皂苷洗出。為了不影響純度,回收44～73瓶,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,水浴蒸干、稱重,得到2.31 g麥冬皂苷D,得率為12.8%。第1瓶到43瓶可能是低糖基麥冬皂苷,共收得12.5 g。待分離樣品共18.1 g,回收共得到17.2 g,回收率為95.6%。

2.3 高效液相色譜法檢測麥冬皂苷D的純度

采用HPLC方法檢測分離后的麥冬皂苷D的純度。精密稱取分離獲得的麥冬皂苷D樣品1 mg,溶于1 mL色譜甲醇,完全溶解過0.45 μm濾膜,取濾液即得1 mg/mL的供試品,檢測圖譜如圖3所示。從圖3可知其出峰時(shí)間為27.198 min,峰面積占總峰面積的91.2%,麥冬皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為27.251 min,通過比較可以確定樣品為麥冬皂苷D,純度為91.2%。

標(biāo),麥冬皂苷D標(biāo)準(zhǔn)品；總,麥冬總皂苷；1～83,硅膠柱洗脫分瓶收集的瓶編號

圖3 麥冬皂苷D樣品HPLC圖

3 結(jié) 論

以10 kg麥冬為原料,采用甲醇浸提法提取麥冬皂苷,經(jīng)石油醚脫脂、水飽和正丁醇萃取、去離子水水洗脫糖,得到麥冬總皂苷18.1 g,提取率為0.181%。應(yīng)用硅膠柱層析法進(jìn)行分離純化,用氯仿-甲醇為洗脫劑,當(dāng)V(氯仿)∶V(甲醇)=8∶2時(shí)分離得到較純的麥冬皂苷D樣品,減壓濃縮干燥后得干品2.31 g,得率為12.8%,經(jīng)高效液相色譜檢測可測得麥冬皂苷D的純度為91.2%。

用甲醇浸提法對麥冬總皂苷進(jìn)行提取較其他常規(guī)提取方法簡單可行且提取率高,經(jīng)硅膠柱層析法簡單分離后就可制得純度較高的麥冬皂苷D,滿足實(shí)驗(yàn)室對標(biāo)準(zhǔn)品的要求,為工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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