熒光光譜法研究橙皮素與牛血清白蛋白的相互作用*

尚永輝

（咸陽師范學院 化學與化工學院，陜西 咸陽712000）

科研與開發

熒光光譜法研究橙皮素與牛血清白蛋白的相互作用*

尚永輝

（咸陽師范學院 化學與化工學院，陜西 咸陽712000）

采用熒光光譜技術研究了橙皮素與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。研究發現橙皮素對BSA的熒光猝滅屬于靜態猝滅過程，由熱力學參數焓變△r H m=-60.543 kJ·mol-1，熵變△r S m=-114.121J·mol-1均小于零,判斷橙皮素與BSA之間主要靠氫鍵和范德華力相結合,生成自由能變(△r G m)為負值,表明橙皮素與BSA的作用過程是一個自發過程;并應用同步熒光光譜考察了橙皮素對BSA構象的影響。

橙皮素；牛血清白蛋白；熒光光譜

Abstract:The interaction behavior between Hesperetin and Bovine Serum Albumin(BSA)was studied by fluorescence spectroscopy.The quenching constants were obtained at 292K,299 K,311K and 315t K,the results indicated that the fluorescence quenching mechanism for BSA through Hesperetin binding is likely a static quenching process.The thermodynamic parameters,enthalpy change (△r H m)and entropy change(△r S m),were calculated to be-60.543 kJ·mol-1＜0,and-114.121J·mol-1＜0,respectively,which indicated that the interaction of Hesperetin with BSA was driven mainly by hydrogen bond and Van der Walls force.The process of binding was a spontaneous process in which Gibbs free energy change(△r G m)was negative.The effect of Hesperetin on the conformation of BSA was analyzed using synchronous fluorescence spectroscopy.

Key words:Hesperetin;Bovine Serum Albumin（BSA）;fluorescence spectroscopy

藥物進入人體首先與血清白蛋白結合，通過血漿的存儲和運輸到達受體部位產生藥理作用[1]。因此，從不同角度研究蛋白與藥物分子間的相互作用已成為目前藥物研究的熱點問題之一。熒光光譜法是目前研究蛋白質與各種小分子以及離子相互作用的重要手段之一，通過研究，可獲得蛋白質分子中熒光生色基團結構和所處微環境及其分布情況等信息，同時還可得到外源物質與生物大分子相互作用的有關數據。

橙皮素（Hesperetin）屬于雙氫黃酮類化合物，能有效抑制脂肪分解，促進DNA生物的合成，具有健胃、祛痰、鎮咳、利尿以及抗氧化、抗腫瘤等多種功效。實驗在pH值為7.40的Tris-HCl介質中運用熒光光譜技術研究了橙皮素與BSA的相互作用，并對其作用機理進行了初步分析。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白（Amresco.0930，分子量:65000）；橙皮素（中國藥品生物制品檢定所）；pH值為7.40的Tris-HCl緩沖溶液。

以Tris-HCl緩沖溶液分別配制濃度均為1.0×10-3mol·L-1的BSA和橙皮素標準溶液，兩種標準溶液均在0～4℃的冰箱中保存。實驗所需濃度由此稀釋而得。實驗所用其他試劑為分析純；水為雙重蒸餾水。

RF-5301型熒光分光光度計（日本島津公司）;UV-8453紫外分光光度計（日本日立公司）；HA-180MF電子分析天平（日本日立公司）;TB-85型恒溫水浴（日本島津公司）；pHSJ-4A pH計（上海雷磁儀器廠）。

1.2 實驗方法

在10mL比色管中依次加入pH值為7.40的Tris-HCl緩沖溶液 2.0mL、1.0×10-4mol·L-1BSA溶液1.00mL以及一定梯度量橙皮素標準溶液，采用雙重蒸餾水稀釋至刻線，搖勻，在一定溫度下恒溫1h后以285nm為激發波長繪制300～500nm的熒光發射光譜以及Δλ=60nm，Δλ=15nm的同步熒光光譜，測定測定中光譜帶寬均為3nm。

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

按照 1.2 方法分別測定 292，300，310，315K 溫度下橙皮素對BSA的熒光猝滅光譜，310 K的熒光光譜見圖1。

圖1 橙皮素對BSA熒光光譜的影響（T=310K）Fig.1 Fluorescence quenching spectra ofHesperetin-BSA(at310K)

由圖1可知，隨著橙皮素濃度的逐漸增加BSA的熒光強度逐漸降低，最大發射波長由340nm逐漸紅移至350nm，這是由于BSA中的色氨酸和酪氨酸等殘基使其具有一定的內源熒光，加入的外源性物質橙皮素與BSA之間產生相互作用導致BSA的內源熒光有規律的猝滅。

2.2 熒光猝滅機理及猝滅常數的測定

引起熒光猝滅的原因有動態猝滅和靜態猝滅兩種，隨溫度的升高動態猝滅過程猝滅常數增大，而靜態猝滅過程猝滅常數減小，可由此判斷熒光猝滅得類型。不同溫度下橙皮素對BSA熒光猝滅方程（Stern-Volmer方程）及猝滅常數見表1。

表1 不同溫度下橙皮素對BSA的猝滅常數Tab.1 Stern-Volmer quenching constantatdifferent temperatures

由表1可知，隨溫度升高猝滅常數逐漸減小，表明該猝滅過程是由于以靜態猝滅為主。此外，各類猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數K q為2×1010L·（mol·s）-1[2]，橙皮素對 BSA 的 K q 遠大于該值，進一步判斷橙皮素對BSA的熒光猝滅過程以靜態猝滅為主。

2.3 牛血清白蛋白與橙皮素結合反應的熱力學性質及作用力

分子間的作用力包括氫鍵，范德華力，靜電引力，疏水作用力等，根據文獻[2]計算310、315K溫度下橙皮素與BSA結合作用的熱力學參數：自由能變△r G m=-25.166kJ·mol-1（310K），△r G m=-24.709 kJ·mol-1（315K），焓變△r H m=-60.543 kJ·mol-1，熵變△r S m=-114.121J·mol-1。△r G m＜0表明橙皮素與BSA的相互過程為自發進行，根據Ross等總結出的判斷生物大分子與小分子結合力性質的熱力學規律△r S m＜0，△r H m＜0推斷橙皮素與BSA之間的作用力以為氫鍵和范德華力為主。

2.4 橙皮素與BSA的表觀結合常數Kb以及結合位點數n

小分子與大分子結合時其表觀結合常數Kb與結合位點數n由下式求出[5]:

lg[（F0-F）/F]=lg Kb+n lg[Q]

分別繪制橙皮素與 BSA 的 lg（F0-F）/F～lg[Q]的雙對數圖，根據方程的截距，斜率求得相應的Kb和n，見表 2。

表2 不同溫度下，橙皮素與BSA的表觀結合常數Kb以及結合位點數nTab.2 The binding constants Kband the binding numbers n of Hesperetin-BSA atdifferent temperatures

由表2可知，橙皮素與BSA結合時的結合位點數n接近1，結合常數Kb值在高于104數量級，表明橙皮素與BSA結合可形成具有1個結合位點，結合作用較強的非熒光復合物，橙皮素可以被蛋白質運輸和儲存。

2.5 同步熒光光譜

芳香氨基酸殘基的最大熒光發射波長與其所處的環境極性有關，通過熒光發射波長的改變可判斷芳香氨基酸殘基所處微環境的變化，Δλ=15nm，60nm的同步熒光光譜分別顯示酪氨酸殘基，色氨酸殘基的光譜特征[3]。固定BSA濃度為0.1×10-4mol·L-1逐步改變橙皮素的濃度繪制Δλ=15nm，Δλ=60nm的同步熒光光譜（圖略），發現：酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強度均隨著橙皮素濃度的增加而被猝滅，且熒光譜發射峰的位置均發生了微小的紅移，表明橙皮素對酪氨酸殘基，色氨酸殘基微環境疏水性降低，親水性增加[3]。此外色氨酸殘基熒光峰發射峰與BSA的熒光發射峰位置相近，且色氨酸殘基猝滅程度比酪氨酸殘基更為顯著，表明BSA的熒光主要由色氨酸殘基所貢獻，橙皮素與BSA的結合位點更接近于色氨酸殘基。

3 結論

在pH值為7.40的Tris-HCl緩沖體系中采用熒光光譜技術研究了橙皮素與BSA的相互作用。結果表明：橙皮素對BSA的熒光猝滅過程屬靜態猝滅，結合過程是靠氫鍵和范德華力相結合的自發反應過程，應用同步熒光光譜考察了橙皮素對BSA構象的影響。

［1］胡艷軍，劉義，侯安新.化學學報［J］.2004，62（16）:1519-1523.

［2］安道利，李建晴，智慧，分析科學學報［J］.2008，24（3）:311-314.

［3］楊曼曼，楊頻，張立偉.科學通報［J］.1994，39（1）：31-35.

Study on the interaction between hesperetin and bovine serum album in by fluorescence spectroscopy*

SHANG Yong-hui
（School of Chemistry ＆ Chemical Engineering，Xianyang Normal University，Xianyang 712000，China）

O657.34

A

1002-1124（2011）01-0012-03

2010-11-30

國家自然科學基金項目（20975081）；陜西省教育廳科研計劃項目（2010JK899）；西北大學研究生交叉學科資助項目（07YJC09）

尚永輝（1978-），男，陜西寶雞人，碩士，講師，2002年畢業于陜西師范大學分析化學專業，主要從事藥物化學研究及教學工作。