RT-PCR聯合檢測早期非小細胞肺癌中多基因表達在評估術后化療療效的意義

陳瑜 楊立 潘泓 劉德森 茅乃權 黃耀元

廣西醫科大學附屬腫瘤醫院胸外科，廣西 南寧530021

肺癌已經成為全球癌癥患者的首要死因，非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancers，NSCLC)占肺癌的85%，其中主要為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌。Chen等［1］關于中國肺癌流行病學趨勢的研究結果顯示，2005年我國新增肺癌病例和死亡病例分別為536 407和475 768例，男性多于女性；1988年—2005年期間年均增長1.6%。盡管肺癌的5年生存率從上個世紀60年代早期的8%提高到了90年代早期的15%，但仍有相當大的上升空間。目前，早期NSCLC患者完全切除術后是否需要進行常規輔助化療仍存在較大的爭議。隨著分子生物學的發展，人們認識到腫瘤組織細胞表達的改變、結構的改變以及蛋白功能的改變是影響其生物學活性的最根本因素。由于NSCLC進行輔助化療能否獲益是由其分子機制決定的，所以如果有生物標記作為標準來幫助篩選患者進行治療，不僅能提高療效，還可避免不必要的藥物不良反應。潘泓等［2］從30種化療相關蛋白中篩選出ERCC1、survivin、bax、VEGF 4個基因，發現其聯合檢測對早期NSCLC術后化療療效的預測特異度達96.5%。本研究在此基礎上進一步應用熒光定量PCR技術檢測ERCC1、survivin、bax、VEGF基因在早期NSCLC中的表達及其對術后化療療效的價值。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

2004年12月—2009年9月在我院住院并采用肺葉切除+淋巴結清掃手術治療的87例肺癌患者，年齡35～77歲，均經病理組織學證實為NSCLC。其中鱗癌42例，腺癌26例，腺鱗癌18例，其他癌1例。臨床分期采用國際肺癌研究協會(IASLC)2009年第七版分期標準(IASLC 2009)，Ⅰ期23例，Ⅱ期64例。所有患者均為首次發現肺癌，術前未行任何化療和放療。患者于術后3～4周開始使用以鉑類為主的化療方案，共化療3～4個周期，療程結束后，定期隨防。根據生存期將87例患者分為2組，存活3年或長于3年者為預后好組(n=41)，中位生存期為46個月；存活短于3年者為預后差組(n=46)，中位生存期為27個月。

1.2 材料

TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄酶試劑盒(美國Promega公司)；PCR試劑(Genstar公司)；膠回收試劑盒(杭州BioFlux公司)；SYBR Green I 染料(中國Generay公司)。根據GenBank所發布的ERCC1、bax、survivin、VEGF、GAPDH基因序列，應用引物設計軟件Primer 5.0設計引物序列，并經GenBank Blast檢索無顯著同源性。PCR引物合成(上海生物工程技術有限公司)，選用GAPDH作為內參。多通道PCR儀(美國MJPT-220)；紫外分光光度計(日本島津SHIMADIU UV-1700)；凝膠電泳成像分析系統(美國Bio-Rad公司GelDoc2000型)；實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物的設計與合成

NCBI搜索目的基因的序列，用Primer 5.0設計基因的引物。ERCC1上游引物：5’-CCCTGGGAATTTGGCGACGTAA -3’，下游引物：5’-CTCCAGGTACCGCCCAGCTTCC-3’，產物長度：223 bp；survivin上游引物：5’-GCCAGATTTGAATCGCGGGA-3’，下游引物：5’-GCAGTGGATGAAGCCAGCCT-3’，產物長度：1 8 5 b p；b a x上游引物：5’-CCTTTTGCTTCAGGGTTTCAT-3’，下游引物：5’-AGTCTGTGTCCACGGCG-3’，產物長度：188 bp；VEGF上游引物：5’-AAGATCCGCAGACGTGTAAATGTT-3’，下游引物：5’- CGGCTTGTCACATCTGCAAG-3’，產物長度：100 bp；GAPDH上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，產物長度：225 bp。

1.3.2 組織RNA的提取與鑒定

分別取液氮凍存的肺癌組織，加TRIzol后按試劑說明書操作步驟進行 RNA提取，測定D260nm，計算RNA濃度。

1.3.3 逆轉錄反應

取2 μL RNA模板做逆轉錄反應，反應體系：組織RNA 2 μL，OligoDT18 (0.5 μg/μL)1 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，MMLV(1 ×107U/L) 0.5 μL，RNA enzyme inhibitor 0.5 μL，DEPC水13 μL，總體積為22 μL，反應條件為37 ℃ 1 h，然后95 ℃ 3 min。

1.3.4 熒光定量標準品的制備

取經檢驗后可表達ERCC1、bax、Sur vivin、VEGF和GAPDH基因的模版，用普通PCR反應進行大量擴增，回收PCR產物，連接到E-ZT載體上。同樣方法制作GAPDH標準品。

1.3.5 SYBR Green Ⅰ熒光實時定量PCR 測定

根據D值確定濃度，將標準品梯度稀釋為6個梯度(109、108、107、106、105和104)，作為模板進行Real-time PCR并制作標準曲線。20 μL反應體系包括：10×PCR buffer 2 μL，上游引物為(10 μmol/L) 0.4 μL，下游引物為(10 μmol/L) 0.4 μL，dNTPs (2.5 mmol/L)0.8 μL，SYBR Green Ⅰ 0.5 μL，Taq酶0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 14.7 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；59 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，讀板1次，升溫到90 ℃ 0.02 s，讀板1次，共40個循環。最后是72 ℃ 10 min延伸。56～100 ℃，每隔0.4 ℃讀板1次，獲得熔解曲線。

1.4 數據整理

目的基因與內參基因同時在熒光定量PCR儀上反應。每個基因設立空白對照(不含模板的反應體系)、標準品、樣本同時進行擴增，每個樣品均設3個平行管，擴增反應至少重復2次。PCR擴增反應完成后，儀器自行進行數據分析，給出各個樣品的Ct值(達到樣品熒光閾值的循環數)與SQ值(Starting Quantity起始模板數)。Ct值與SQ值的對數值之間存在著線性關系，以質粒的拷貝數對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標，可得標準曲線，再根據各個樣品的Ct值，讀取標準曲線中對應的起始拷貝數，以此對每個樣品cDNA進行定量分析。定量結果以SQ值表示。為了消除每個樣品反應時cDNA量的不同，根據公式F=目的基因平均SQ值/GAPDH基因平均SQ值來進行校正，得到樣本各個基因的相對表達量。

1.5 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行分析處理。患者年齡、性別、組織學類型、TNM分期和ERCC1、survivin、bax、VEGF表達采用COX模型進行多因素回歸分析；ERCC1、survivin、bax和VEGF基因的mRNA在肺癌組織中表達相關性采用相關分析(秩相關)，預后好組和預后差組兩組樣本各個基因拷貝數的比較采用秩和檢驗，4種基因在不同病理類型和分期中表達的比較采用秩和檢驗，生存分析的比較用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 質粒測序結果

重組基因質粒經PCR和測序核實，VEGF有1個堿基突變，為無意突變，重組基因質粒構建成功。

2.2 陽性標準品實時熒光擴增標準曲線

通過ERCC1、survivin、bax、VEGF、GAPDH質粒初始拷貝數與實時熒光定量檢測的Ct值建立的標準曲線相關系數＞0.995，可以作為檢測本組基因的良好標準品。

2.3 實時熒光擴增熔解曲線

熒光定量PCR的熔解曲線顯示，采用熒光染料進行各濃度質粒ERCC1、survivin、bax、VEGF、GAPDH基因實時熒光定量檢測，均出現單一的熔解峰，結果特異性好。

2.4 兩組患者臨床病理資料的對比分析

兩組患者的病理類型、臨床分期和化療方案的差異無統計學意義(P>0.05)，而兩組患者的生存時間差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.5 COX多因素回歸分析結果

COX模型多因素回歸分析發現，患者年齡、性別、組織學類型、TNM分期和ERCC1、survivin、bax、VEGF表達均不是影響患者預后的獨立因素，并且ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達量之間沒有明顯相關性。

表l 兩組患者臨床病理資料的對比分析Tab.1 Comparative analysis of clinical and pathological data of two groups of patients

2.6 ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達量在預后好組和預后差組的比較

表達量的比較：ERCC1在兩組比較中，腺癌、鱗癌預后好組與預后差組的比較其差異有統計學意義(P=0.010；P=0.021)，腺鱗癌其兩組比較差異無統計學意義(P=0.061)；Ⅰ期其兩組比較差異有統計學意義(P=0.033)，Ⅱ期差異無統計學意義(P=0.051)。survivin在兩組比較中，腺癌、鱗癌其兩組的比較差異有統計學意義(P=0.012；P=0.023)，腺鱗癌其兩組的比較差異無統計學意義(P=0.135)；Ⅰ期和Ⅱ期其兩組的比較差異均有統計學意義(P=0.041；P=0.037)。bax在兩組比較中，腺癌、腺鱗癌其兩組比較的差異均有統計學意義(P=0.009；P=0.032)，而鱗癌其兩組比較差異無統計學意義(P=0.54)；Ⅰ期和Ⅱ期其兩組比較差異均有統計學意義(P=0.034；P=0.012)。VEGF在兩組比較中，腺癌、鱗癌和腺鱗癌3組比較差異均有統計學意義(P=0.009；P=0.016；P=0.003)；Ⅰ期和Ⅱ期其兩組比較差異有統計學意義(P=0.013，P=0.008)。本研究結果發現ERCC1、survivin、bax、VEGF在總的預后好組和預后差組各病理分型與分期表達量比較差異均有統計學意義(表2)。

2.7 ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達與生存期的關系

在87例肺癌組織中，將ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達量分高、低表達者。ERCC1以中位數8.56為界，≤8.56為低表達者，＞8.56為高表達者，高表達者的中位生存期為41個月，低表達者的中位生存期為38個月，差異無統計學意義(P=0.037，圖1A)；survivin以中位數6.26為界，≤6.26為低表達者，>6.26為高表達者，高表達者的中位生存期為37個月，低表達者中位生存期為45個月，差異無統計學意義(P=0.138，圖1B)；bax以中位數5.07為界，≤5.07為低表達者，>5.07為高表達者，高表達者的中位生存期為45個月，低表達者的中位生存期為39個月，差異無統計學意義(P=0.562，圖1C)；VEGF以中位數4.05為界，≤4.05為低表達者，>4.05為高表達者，高、低表達者的中位生存期為41個月，低表達者的中位生存期為40個月，差異無統計學意義(P=0.114，圖1D)。將符合ERCCl和survivin低表達、bax和VEGF高表達的15例與ERCCl和survivin高表達、bax和VEGF低表達的10例作生存分析，符合ERCCl和survivin低表達、bax和VEGF高表達的15例中位生存期為48個月，而ERCCl和survivin高表達、bax和VEGF低表達的10例中位生存期為18個月，差異有統計學意義(P=0.029，圖1E)。

表2 ERCC1、survivin、bax、VEGF的表達量在預后好組和預后差組的比較Tab.2 The comparison of the expression of ERCC1, survivin, bax and VEGF between the good prognosis group and the relatively poor prognosis group

圖1 不統基因表達情況下的患者生存分析Fig.1 Survival curves of patients with different genes expression

3 討 論

腫瘤分期是預測NSCLC患者生存率最有力的指標，這一點已廣為認同。如能將判斷預后的分子標志作為選擇治療方法的標準，既可以提高療效，又能使不能受益的患者積極采取其他干預措施避免不必要的化療引起的不良反應。張楠等［3］的研究表明，與腫瘤化療相關的基因有：藥物動力學相關基因、各種生物酶相關基因、DNA損傷與修復相關基因、凋亡相關基因、致癌和抑癌基因、細胞增殖和轉移相關基因等。目前有不少前瞻性的研究正在評估這些頗具希望的預后標志物未來的應用價值，但尚未找到可指導臨床治療的標志物。NSCLC術后化療效果不佳是多因素、多基因參與的復雜過程，各個機制間存在相互交叉、相互依賴的關系，制定一個有效的、指導NSCLC術后化療的分子指標需要進行多因素分析，因此本研究選擇了一組基因進行預測早期NSCLC術后化療療效，并指導臨床。

ERCC1基因是第一個克隆而得的人類DNA損傷修復基因[4]，定位于19號染色體上，屬于核切除修復基因家族，編碼一種蛋白質，這種蛋白質能與修復復合體的其他成員協同通過修復核苷酸的化學變化和結構改變以確保基因組的完整性。ERCC1在維持組織修復功能中占有重要地位，有研究表明，肺癌中ERCC1高表達，往往導致癌細胞對鉑類制劑耐藥從而導致化療療效差，影響生存率，這可能與ERCC1在修復損傷并維持基因組穩定性中發揮重要作用有關［5-6］。Survivin又名生存素，是細胞凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPS)成員［7］。近來有研究表明，survivin是內在腫瘤抑制網絡的通用靶位，survivin位點被認為是抗腫瘤藥物的新型靶點［8］。bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員，Bcl-2和bax通過阻斷凋亡信號通路中的最后共同通道而抑制細胞凋亡［9］。新的觀點認為，對不同的腫瘤bax所起的作用可能不同；同一種腫瘤在不同的階段，bax所起的作用也可能不同。VEGF是一種分子質量為46×103的高度糖基化的堿性蛋白，為血小板源生長因子(PDGF)家族的一個成員，可由正常細胞和腫瘤細胞產生和分泌，VEGF可刺激血漿纖維蛋白等外滲并沉積在細胞外基質，作為腫瘤基質和毛細血管網形成的基礎［10］。本實驗發現ERCC1、survivin、bax、VEGF在預后好組和預后差組各病理分型和臨床分期中表達量的比較差異并非均有統計學意義，但是87例早期NSCLC患者總的癌組織中ERCC1、survivin、bax、VEGF這一組基因的表達量在預后好組和預后差組的比較差異均有統計學意義，表明ERCC1、survivin、bax、VEGF是一組可以判斷早期NSCLC術后化療效果的指標。本研究將符合ERCC1和survivin低表達、bax和VEGF高表達的15例與ERCC1和survivin高表達、bax和VEGF低表達的10例作生存分析，發現差異有統計學意義，表明ERCC1和survivin低表達、bax和VEGF高表達的早期NSCLC患者術后化療的效果好，而ERCC1和survivin高表達、bax和VEGF低表達的早期NSCLC患者術后化療的效果較差，與潘泓等［2］對早期NSCLC的研究相一致。

總之，ERCC1和survivin高表達、bax和VEGF低表達的NSCLC患者，術后生存期較短，對化療可能不敏感，術后化療意義不大，應采取以靶向治療和生物治療為主的治療方法；而對ERCC1和survivin低表達、bax和VEGF高表達的NSCLC患者，行術后輔助化療可取得更好的效果。因此，ERCC1、survivin、bax、VEGF聯合檢測可成為判斷早中期肺癌化療療效及生存期的檢測手段，有助于確定治療方案，以提高術后生存率。

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