對1株腸膜明串珠菌生長曲線和世代時間的初步探討

王 呈，梁茂文，趙瑞生，薛艷蓉，田 歌

（山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西太原030032）

腸膜明串珠菌具有優良的發酵特性，它能夠發酵生成CO2和多種風味化合物[1]，可改善發酵乳制品的口味[2]，它的一些菌株可利用蔗糖生成葡聚糖，從而大大提高發酵乳制品的品質[3]。因而，在發酵乳制品中，它是占有重要地位的發酵劑菌種之一，并得到廣泛應用。

腸膜明串珠菌屬明串珠菌屬（Leuconostoc），有乳脂亞種、葡聚糖亞種和腸膜亞種3個亞種[4]。

本試驗選用可生成葡聚糖的腸膜明串珠菌腸膜亞種LA-07，并經長期在脫脂牛乳中培養馴化后，將其在新鮮脫脂牛乳和MRS肉湯培養基中分別培養，通過平板計數法來獲取其不同培養時間的菌數，并繪制生長曲線和計算世代時間，為進一步開展腸膜明串珠菌在牛乳發酵制品中的應用研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌種

腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leu.mesenteroides subsp.mesenteroides）LA-07，由山西省農業科學院畜牧獸醫研究所畜產品研究室保藏。

1.2 培養基和稀釋液

1.2.1 脫脂牛乳培養基 采用山西省農業科學院畜牧獸醫研究所養牛中心提供的新鮮無抗牛乳，經脫脂后，分裝于用硅膠塞密封的三角瓶中，在115℃下滅菌15 min。

1.2.2 MRS肉湯培養基、MC培養基 其均為北京陸橋技術有限責任公司產品。

1.2.3 稀釋液 0.1%蛋白胨，0.85%氯化鈉，pH值為6.8～7.0，在115℃下滅菌15 min。

1.3 試驗設備

生物潔凈工作臺：型號BCM-1300A，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司產品。隔水式電熱恒溫培養箱：型號PYX-DHS-400-BS-Ⅱ，上海賀德實驗設備有限公司產品。不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器：型號YM50，上海三申醫療器械有限公司產品。電熱恒溫鼓風干燥箱：型號101-1-S-Ⅱ，上海躍進醫療器械廠產品。電子天平：型號FA1104N，上海民橋精密科學儀器有限公司產品。多功能紅外爐：型號MC-H21S011，廣東美的生活電器制造有限公司產品。電動乳脂分離機：型號9ND50，青海農牧機械制造有限公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種的活化 將LA-07接到MRS肉湯培養基中（接種量為2%），于（30±1）℃活化培養，活化3代后為計數培養菌種備用（使用時搖勻）。1.4.2 活菌計數 用移液槍吸取2 mL計數培養用菌種液，分別加到含100 mL脫脂牛乳培養基和MRS肉湯培養基的三角瓶中，置恒溫培養箱中培養（30℃）；從培養0 h起，每隔2 h取菌液進行活菌計數，菌液取10-4～10-9稀釋度各100 μL用滅菌的三角涂布棒涂布于MC培養基平板上，30℃培養48 h，計算活菌數（cfu/mL）。活菌計數方法及數據處理參照GB4789.35—2010[5]。

1.4.3 生長曲線制作和世代時間計算 以各培養時期活菌數的常用對數值為縱坐標、培養時間為橫坐標，繪制生長曲線；取對數生長期中的一段，計算世代時間：G＝t lg2/（Mt-M0）[6]。式中，G為世代時間，t為培養時間，M0為開始時的活菌數對數值，Mt為經t時間培養后的活菌數對數值。

2 結果與分析

2.1 生長曲線的繪制

按1.4.2進行活菌計數，并計算其常用對數值，結果如表1所示。再由表1中的數據繪制出腸膜明串珠菌的對數生長曲線（圖1）。

表1 各培養時期活菌數及其對數值隨時間的變化趨勢

由圖1可知，在新鮮脫脂牛乳和MRS肉湯培養基中，腸膜明串珠菌LA-07的生長均滿足對數生長曲線規律。由于生長基質不同，LA-07在新鮮脫脂牛乳培養基中生長延遲期較長，繁殖較慢。

2.2 添加趨勢線和趨勢線方程

2.2.1 新鮮脫脂牛乳培養基中LA-07生長趨勢線和趨勢線方程 對表1中LA-07在脫脂乳培養基生長的原始數據添加趨勢線（圖2），可獲得趨勢線方程為：y＝5×10-9x6－5×10-7x5＋1×10-6x4＋0.000 3x3－0.007 6x2＋0.049 9x＋7.367 1（R2＝0.997 8） （1）

由圖2可知，LA-07在脫脂乳培養基生長的延遲期為18 h，18～32 h進入對數期，32～42 h進入穩定期，42 h以后進入衰亡期。

2.2.2 MRS肉湯培養基中LA-07生長趨勢線和趨勢線方程 對表1中LA-07在MRS肉湯培養基生長的原始數據添加趨勢線（圖3），可獲趨勢線方程：y＝－2×10-5x4＋0.000 7x3－0.000 4x2－0.005 7x＋7.426 4（R2＝0.995 6） （2）

從圖3中可獲得LA-07在MRS肉湯培養基生長的延遲期為8 h，8～22 h進入對數期，22～28 h進入穩定期，28 h以后進入衰亡期。

2.3 世代時間的計算

2.3.1 新鮮脫脂牛乳培養基中LA-07的世代時間的計算 在新鮮脫脂牛乳培養基中，LA-07生長對數期為 18～32 h，取 x1＝t1＝20 h，x2＝t2＝30 h，t＝t2－t1＝10 h ，將 t1，t2分別代入方程（1），得 y1＝M0＝8.045 1，y2＝Mt＝9.619 1，則世代時間 G乳＝1.912 h≈114.7 min。

2.3.2 MRS肉湯培養基中LA-07世代時間的計算 在MRS肉湯培養基中，LA-07生長對數期為 8～22 h，取 x1＝t1＝10 h，x2＝t2＝20 h，t＝t2－t1＝10 h，將 t1，t2分別代入方程（2），得 y1＝M0＝7.829 4，y2＝Mt＝9.712 4，則世代時間 GMRS＝1.598 h≈95.9 min。

3 結論與討論

本試驗針對同一個菌株，采用了同一菌種、相同的菌種活力、相同的接種量、相同的培養溫度，研究其在2種不同培養基條件下的生長曲線和世代時間。結果表明，腸膜明串珠菌LA-07在MRS肉湯培養基中，生長周期短，在28 h后就進入衰亡期，而在新鮮脫脂牛乳培養基中則要42 h；腸膜明串珠菌LA-07在MRS肉湯培養基中的延遲期和穩定期分別為8，6 h，均要比其在新鮮脫脂牛乳培養基（18，10 h）中少，而腸膜明串珠菌LA-07在2種培養基中的對數期相同，都為14 h；腸膜明串珠菌LA-07在2個不同培養基中的世代時間分別為：G乳=114.7 min，GMRS=95.9 min。

通過在2種不同培養基中的生長周期、延遲期、世代時間對比，說明腸膜明串珠菌LA-07在MRS肉湯培養基中的生長優于其在新鮮脫脂牛乳培養基。

通過在2種不同培養基中的穩定期對比，說明在保持菌種活力方面，新鮮脫脂牛乳培養基要優于MRS肉湯培養基。

處于對數期的微生物，由于其代謝旺盛，生長迅速，個體形態和生理特性較一致。因而，其是發酵制品生產和科學研究的良好材料。為了較準確地劃分微生物生長的各個時期，避免因個別試驗數據的偏差而造成整體試驗結論的偏移，本試驗采用了添加趨勢線的分析方法，不僅可較理想的劃分微生物生長的不同時期，同時還能較精確的計算其世代時間。

對于腸膜明串珠菌LA-07在2種培養基中的對數生長期相同，是否有其一定的必然性，還有待于進一步研究。

［1］Hemme D，Foueaud C.Leuconosotc characteristics，use in dairy technology and prospects in functional food[J].Int Daiyr J，2004，14：467-494.

［2］ Vrdamuhtu E R.The Daiyr Leuconosotc：Ues in dairy products[J].J DairySci，1994，77：2725-2737.

［3］Duboc Molle B.Applications of exopolys accharides in the dairy industry[J].Int DairyJ，2011，11：759-768.

［4］凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業出版社，1999.

［5］Harrigan WF.食品微生物實驗室手冊[M].李衛華，方紅，廉慧鋒，等，譯.北京：中國輕工業出版社，2004.

［6］武漢大學，復旦大學生物系微生物學教研室.微生物學[M].3版.北京：高等教育出版社，1989.