活體MR成像監測移植干細胞治療SD大鼠心肌梗死并評價左心功能的可行性研究

曹 劍，王怡寧*，孔令燕，薛華丹，馬國濤，雷 晶，何泳藍，李 琢，金征宇，孟 潔

近年來，細胞療法(cell-based therapy)已經成為治療缺血性心肌病的一種選擇[1-2]。動物模型及臨床心梗患者的研究結果表明，干細胞移植治療對心梗后左室重構及心室功能的改善都有積極意義[3-5]。干細胞移植途徑選擇最多的為經冠脈注射和心肌內直接注射。雖然前者在介入操作下可以對目標血管進行灌注給藥，但是當冠脈閉塞時，后者更具有優勢，可以對靶心肌進行注射給藥以達到治療目的[6]。既往涉及小動物模型的研究中，多采用有創性手段檢測心功能，提取病理組織標本對移植細胞進行監測[7-8]，這些手段對于今后臨床應用不是最佳選擇。在臨床心臟成像方面，磁共振檢查已經成為常規項目，其中1.5 T MR成像儀是目前應用最廣泛的。本研究通過建立心梗模型并選擇心肌內直接注射方式移植超小超順磁性氧化鐵(USPIO)標記的干細胞，探索利用臨床型1.5TMR成像儀對移植干細胞進行活體監測、同時對小動物心功能進行無創性評估的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠15只，隨機分為空白對照組(n=5)和實驗組(n=10)，性別不限，體重320～370 g，購自北京協和醫院動物實驗中心。本研究獲得中國醫學科學院北京協和醫院倫理審查委員會同意。

1.1.2 實驗試劑

SD大鼠脂肪來源干細胞(adipose derived stem cells, ADSCs)及完全培養基(賽業(廣州)生物科技有限公司)，USPIO (Bayer Schering Pharma AG公司, 德國)，0.01%多聚賴氨酸(PLL)(Sigma, 美國)，MTS(Promega, 美國)。

1.1.3 實驗設備

1.5T超導型磁共振掃描儀(Signal Excite HD，GE，美國)，ALC-V8D小動物呼吸機(北京吉安得爾科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 USPIO體外標記SD大鼠ADSCs

配制濃度為USPIO 40 μg Fe/ml、PLL 1.5 μg/ml的含鐵培養基，其中PLL作為轉染劑，將狀態良好的ADSCs在37℃、5% CO2條件下培養孵育過夜(24 h)。選擇普魯士藍染色和透射電鏡檢查對標記有效性進行檢測：普魯士藍染色可將USPIO顆粒染成藍色，光學顯微鏡下觀察并計算標記陽性率；透射電鏡可直接觀察到USPIO顆粒是否位于ADSCs內部。

1.2.2 標記安全性檢測

選擇MTS(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfopheny)-2H-tetrazolium, inner salt)比色分析法對不同濃度的USPIO(濃度梯度：0、10、20、40、80、160 μg Fe/ml)標記細胞的安全性進行檢測，利用酶標儀比色檢測，評價標記安全性。

1.2.3 建立SD大鼠心梗模型及心肌注射標記ADSCs

空白對照組(n=5)不做任何處理，實驗組(n=10)于腹腔麻醉成功后行氣管穿刺插管，小動物呼吸機輔助通氣條件下，開胸以6-0聚丙烯(polypropylene)縫線結扎冠脈左前降支(left anterior descending, LAD)，術中監測心電圖，以出現ST段抬高作為心梗成功標志。建模成功后，直視下使用微量注射器于梗死心肌周邊注射標記ADSCs(數量1.0×107，體積100 μl)，縫合關胸，觀察15 min后拔管脫機。

表1 掃描序列參數Tab 1 Detail parameters of the sequences

圖1 普魯士藍染色及透射電鏡結果。1A：普魯士藍染色光鏡圖片(×200)，藍色為鐵顆粒，標記陽性率接近100%，藍染顆粒多位于細胞核周圍；1B：透射電鏡圖片(×25000)，黑色USPIO顆粒(箭頭)位于溶酶體中Fig 1 Results of Prussian blue staining and TEM.1A: Prussian blue staining (×200), blue particles around the nuclear could be visualized almost in all cells; 1B: 1B: The black USPIO particles (arrow) are showed in the lysosome by TEM(×25,000).

1.2.4 心臟磁共振成像示蹤標記ADSCs

空白對照組及實驗組均行心臟磁共振成像，空白對照組時間不限，實驗組于注射標記細胞后第3天進行。SD大鼠于磁共振檢查前行腹腔麻醉，前胸備皮后粘貼電極片以實現心電門控。掃描采用3英寸線圈，參照美國心臟協會推薦的心臟標準解剖平面，選擇快速平衡穩態進動序列(fast imaging employ steadt state acquisition, FIESTA)和快速擾相位梯度回波(fast spoiled gradient recalled echo, FSPGR)序列進行掃描，實驗組加掃2D MDE延遲強化序列(對比劑選用Gd-DTPA, 0.2 ml/100 g；具體參數見表1)。

1.2.5 評估SD大鼠左室心功能

圖2 正常SD大鼠(2A, HR 340 bpm)及急性心梗SD大鼠(2B, HR 357 bpm)心電圖，心梗鼠心電圖可見明顯ST段抬高性改變Fig 2 ECG of normal SD rat (2A, HR 340 bpm) and AMI SD rat (2B, HR 357 bpm).The latter showes the elevation of ST segment.

掃描完成后將實驗組和空白對照組Cine序列MR圖像傳輸至Report Card工作站，選取短軸兩腔心電影序列圖像，手動勾畫左室心肌內膜輪廓，計算左室舒張末容積(left-ventricular end-diastolic volume, LVEDV)、左室收縮末容積(left-ventricular end-systolic volume, LVESV)及左室射血分數(leftventricular ejection fraction, LVEF)。

1.2.6 病理組織學檢查

磁共振成像后第2天處死SD大鼠，根據MR圖像及術中縫線切取梗死區心肌，行石蠟切片，進行HE染色觀察心肌結構，普魯士藍染色檢查USPIO分布。

1.2.7 統計學分析

應用t檢驗比較實驗組和空白對照組SD大鼠的LVEDV、LVESV及LVEF，P＜0.05表示具有統計學差異，雙側檢驗。統計分析使用SPSS l8.0軟件。

2 結果

2.1 ADSCs標記及標記有效性、安全性檢測

普魯士藍染色見干細胞內有大量藍染顆粒，部分聚集成團，顆粒分布以核周和靠近細胞膜處較為明顯，偶見標記陰性的細胞，細胞染色陽性率＞99%。透射電鏡于標記細胞胞質內見黑色顆粒聚集，主要位于各級溶酶體內(圖1)。MTS比色分析法顯示培養基中USPIO濃度在0、10、20、40、80和160 μg Fe/ml時，各組細胞活性均保持在90%以上。

2.2 SD大鼠心梗建模及心肌內注射移植標記ADSCs

圖3 正常SD大鼠心臟MR圖像。3A：FSPGR Cine序列，短軸心圖像；3B：FEPGR Cine序列，長軸心圖像；3C：FIESTA Cine序列，短軸心圖像；3D：FIESTA Cine序列，長軸心圖像Fig 3 Cardiac MRI of normal SD rats.Short-axis (3A) and long-axis (3B) images with FSPGR Cine sequence，Short-axis (3C)and long-axis (3D) images with FIESTA Cine sequence.

圖4 實驗組SD大鼠心肌局部注射USPIO標記干細胞后心臟MR圖像。4A：FIESTA Cine序列，短軸心圖像；4B：FEPGR Cine序列，短軸心圖像。左室前壁信號減低明顯可見(黃色箭頭)，部位與手術注射部位一致圖5 運動異常及延遲強化MR圖像。5A：FIESTA Cine序列圖像，黃色箭頭所指為電影序列上所見運動異常區域；5B：2D MDE序列圖像，黃色箭頭所指為延遲強化心肌。兩者位置相符Fig 4 Cardiac MRI of SD rats in experimental group injected USPIO-labled stem cells.Short-axis images with FSPGR Cine(4A) and FIESTA Cine (4B) sequence.The signal of anterior left ventricle decreases signifi cantly (yellow arrow), corresponding with the part of injection.Fig 5 MRI of abnormal movement and late enhancement.MR images with FIESTA Cine sequence demonstrating the area of abnormal movement (5A, yellow arrow), which is correspondecne with the late gadolium enhancement of myocardium (5B,yellow arrow) in 2D MDE images.

實驗組SD大鼠成功建模并完成心肌內干細胞注射移植的共8只，建模成功率80%；另外2只由于術中大出血(n=1)和術后脫機未遂(n=1)而死亡。

結扎SD大鼠LAD后，相應供血區域心肌顏色明顯加深變黑，心電圖出現ST段抬高改變(圖2)。梗死心肌周邊注射標記ADSCs，注射部位心肌略鼓起，穿刺點部位少量出血。

2.3 SD大鼠心臟MR檢查

共有13只SD大鼠進行心臟MR掃描，其中成功完成掃描共10只：空白對照組5只，完成FIESTA Cine和FSPGR Cine序列掃描；實驗組5只，完成FIESTA Cine和FSPGR Cine序列掃描，其中2只還完成2D MDE序列掃描；實驗組中另外3只由于心律不齊(n=2)和麻醉意外死亡(n=1)未能完成掃描。

FIESTA Cine和FSPGR Cine序列均可對SD大鼠心臟結構進行觀察。5只空白對照組大鼠心臟室壁運動規律，心肌信號均勻，未見明顯信號減低區域(見圖3)。實驗組5只大鼠心肌內均可見到明顯低信號區，位于左室前壁，與術中注射部位相符(見圖4)。其中2只進行2D MDE延遲強化序列掃描的SD大鼠心肌內可見延遲強化，位于左室前壁，與其電影序列圖像上室壁運動異常部位相一致(見圖5)。

2.4 心功能評估

實驗組和空白對照組LVEDV、LVESV、LVEF結果見表2。實驗組和空白對照組LVEDV、LVEF的差異具有統計學意義，兩組間的LVESV無統計學差異。

2.5 病理組織學檢查

HE染色見實驗組大鼠梗死心肌呈凝固性壞死：細胞輪廓存在，但細胞核消失，普魯士藍染色于梗死心肌周邊可見局灶性分布藍染顆粒，非注射部位區域亦可見少量藍染顆粒分布。

表2 空白對照組及實驗組SD大鼠心功能測量結果Tab 2 Results of the cardiac function of SD rats in two groups

3 討論

本研究在轉染劑PLL的作用，將USPIO與ADSCs共孵育培養，高效且安全地實現了干細胞的磁共振標記。構建SD大鼠急性心梗模型，于梗死心肌周圍注射USPIO標記干細胞，臨床1.5 T MR成像儀顯示USPIO標記干細胞注射后局部心肌信號明顯減低，利用ReportCard軟件，可以計算SD大鼠心功能，研究結果證實了臨床1.5 T MR成像儀活體示蹤移植USPIO標記干細胞并同時評估大鼠心功能的可行性。

3.1 活體MR成像示蹤USPIO標記干細胞的可行性

移植干細胞通過在微環境作用下的定向分化和分泌相關細胞因子的方式對特定疾病進行治療已經成為近幾年的研究熱點[1,9]。在干細胞移植進入體內后，為了評估細胞療法的機制以及療效，研究人員需要有效地對移植細胞的分布、遷移甚至分化進行監測；在臨床應用時，無創性的監測方式是研究的首選。MRI沒有輻射，有著極佳的組織分辨率和空間分辨率，可同時獲得臨床價值極高的解剖及生理信息[10]，對深部組織的影像學特征進行精細、準確的定位、定量分析，具有其他影像學技術不可比擬的優越性，是一種非常理想的無創性影像學分析技術。而通過MR對比劑(如USPIO、SPIO等)對移植細胞進行體外標記，可使用MR成像儀對移植細胞進行連續、無創、重復性的多時間點監測。

本研究在轉染劑PLL的作用下，將USPIO與ADSCs共孵育培養，通過干細胞自身吞噬作用實現磁共振顯像標記。USPIO標記干細胞移植進入大鼠心肌后，心臟磁共振FIESTA和FSPGR Cine兩種序列圖像均可清楚顯示標記細胞注射區域的信號強度比鄰近正常心肌和梗死心肌更低，呈“黑區”(black spots)，這為我們重復、無創性動態監測標記干細胞提供了可能。Kim等[11]以SPIO標記人骨髓間充質干細胞(hMSC)，然后將標記干細胞于心梗建模后注射至心梗大鼠心肌內，磁共振成像表明直到移植后第10周，仍可以在MR圖像上清楚顯示心肌內低信號區。由于磁共振圖像的信號減低反映的是氧化鐵的信息，因此MR圖像上出現的信號減低并不能直接提示移植的標記干細胞的存活，即會產生假陽性結果，導致過高估計移植后干細胞的存活率。除此之外，心肌出血含鐵血黃素的沉積也會帶來假陽性的問題。假陽性結果需要結合病理染色、免疫組化等多種方式加以排除。但亦有研究表明，標記干細胞死亡后，其胞質內的氧化鐵顆粒短時間內就可以通過特殊途徑離開心肌，因此部分學者認為，心肌內的信號減低可以代表存活的標記干細胞[12]。移植細胞死亡后胞質內鐵顆粒的去向問題，尚有待進一步的研究證實。

3.2 活體MR成像評價心功能的可行性

心臟MR的電影序列(Cine)得到的為亮血信號圖像，血液與心肌之間有著很高的對比度，是觀察心臟室壁運動、測量室壁厚度、計算射血分數的理想選擇[12]。利用這一序列成像，可以實現無創檢測SD大鼠心功能、評估細胞療法治療效果的目的。本研究中，FIESTA和FSPGR兩種序列都可以清楚顯示心臟結構，但FSPGR Cine圖像信噪比要優于FIESTA序列。掃描參數上，FIESTA Cine序列可以實現的最小層厚為3.9 mm，而FSPGR序列為2.3 mm。因此本研究組選擇FSPGR Cine序列進行SD大鼠心功能的計算，結果與國內外學者研究結果相符[11,13-14]。在干細胞移植治療急性心肌梗死的遠期效果方面，目前國內外文獻所展示的心功能的改善程度不一，LVEDV、LVESV變化趨勢也不盡一致[11,13-14]；本研究組后續研究會對ADSCs移植治療SD大鼠急性心肌梗死后進行多時間點監測，以評估干細胞移植治療的有效性，明確心功能各參數的變化趨勢。

3.3 磁共振示蹤成像的不足與展望

磁共振成像的局限性在于敏感性較低，隨著移植干細胞的繁殖、分化和死亡，心肌內氧化鐵的量和濃度會逐漸減低[15]，當低于MR成像敏感性時，磁共振活體示蹤檢測將不能實現。本研究中，病理檢查于非注射部位發現的少量藍染顆粒，磁共振圖像上卻沒有發現相應的可檢測的信號強度改變。因此，為了實現長期監測的目的，一方面可以通過改善MR掃描儀器軟、硬件條件提高成像敏感性，另外可以選擇其他更為敏感地示蹤手段。高敏感性的光學成像是種很好的選擇[16]，通過基因轉導引入熒光素酶基因，需要成像時注射底物，通過底物與酶的作用實現發光。光學的高敏感性與MR的高時空分辨力，是一種理想的多模態成像模式，亦是本研究小組下一步的研究方向。

綜上所述，應用臨床型1.5 T MR掃描儀對標記干細胞進行活體示蹤，同時行心功能測量是可行的，心臟磁共振成像在今后無創性監測干細胞移植的臨床應用中有著廣泛前景。

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