瘀腫消溫度敏感型原位凝膠的提取方法優選

徐曉霞 歐陽榮* 廖建萍

（1 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007；2 湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

瘀腫消溫度敏感型原位凝膠是由生梔仁、大黃、金銀花、當歸等十一味中藥組成，具有活血止痛、清熱消腫、散瘀通絡的作用，臨床上應用于治療急性軟組織損傷，具有消腫止痛快、療程短、療效好的優點，但原劑型（散劑）存在使用不便，易弄臟衣物等不足，阻礙其進一步推廣運用[1]。于是我們根據透皮吸收理論（TTS）[2]，將其改為溫度敏感型原位凝膠[3-5]，本文對其提取方法及工藝研究進行報道。

1 儀器與試藥

Agilent110高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；分析天平DT-100（北京光學儀器廠）；不銹鋼電熱恒溫水浴鍋（北京市醫療設備廠）；KQ-600型超聲波清洗器（昆山市淀山湖檢測儀器廠）。

甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純，水為注射用水。

大黃素、綠原酸、生梔仁等藥材購自湖南三湘中藥飲片有限公司，經湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥檢室鑒定確認。

2 方法與結果

2.1 指標成分的測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil Cl8柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。大黃素流動相：甲醇-0.1%磷酸（82∶18）；檢測波長：254nm；柱溫：45℃；流速：1mL/min。綠原酸流動相：甲醇-0.1%磷酸（28∶72）；檢測波長：327nm；柱溫：25℃；流速：1mL/min。梔子苷流動相：甲醇-0.1%磷酸（28：72）；檢測波長：238nm；柱溫：25℃；流速：1mL/min。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取大黃素對照品5mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取甲醇液5mL到25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度即得大黃素對照品溶液。精密稱定綠原酸、梔子苷各對照品3.5mg、5mg置25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得綠原酸、梔子苷對照品溶液。

2.1.3 標準曲線的制備

精密吸取各濃度的對照品溶液2、4、6、8、10、20μL注入高效液相色譜儀，以峰面積值Y為縱坐標，對照品進樣量X（μg）為橫坐標進行線性回歸，回歸方程為：大黃素Y=4570.1X+4.8197，r=0.9993；綠原酸Y=1278.8X-9.1475，r=0.9998；梔子苷Y=1583.5X-44.638，r=0.9998。結果表明大黃素、綠原酸、梔子苷的進樣量分別在0.04～0.40μg、0.28～2.80μg、0.40～4.0μg的范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.4 供試品溶液的制備

按2.3項下的提取方法得提取液，用0.45μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續濾液，即得供試品溶液。在上述色譜條件下進樣10μL，測定大黃素、綠原酸、梔子苷峰面積。

2.2 浸膏得率的測定

分別精密吸取按2.3項下的提取方法得提取液20mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，在105 ℃干燥3h，取出，置干燥器中冷卻30min后迅速稱重，計算浸膏得率。浸膏得率=（浸膏重量/藥材重量）×100%。

2.3 提取方法的比較

表1 提取方法比較結果表

表2 因素水平表

表3 L9(34)正交試驗結果表

表4 方差分析表

2.3.1 水煎法

取本品12.6g，置圓底燒瓶中，浸泡1.0h，第1次加12倍水、回流提取2.0h，第2次加10倍水、回流提取1.5h。濾過，合并濾液，并定容至200mL。

2.3.2 乙醇回流法

取本品12.6g，置圓底燒瓶中，浸泡1.0h，第1次加10倍70%乙醇、回流提取2.0h，第2次加8倍70%乙醇、回流提取1.5h。濾過，合并濾液，并定容至200mL。

2.3.3 CO2超流界后藥渣用乙醇回流法

取本品250g按CO2超流界最佳萃取條件（萃取壓力30MPa、萃取溫度50℃、萃取時間2h）萃取后，藥渣按2.3.2項下乙醇回流法進行提取。

上述3種方法所得提取液，按2.1.4項下的方法測定含量，結果見表1。

綜合評分=各樣品中大黃素含量/該組中大黃素最大含量×0.3×100+各樣品中綠原酸含量/該組中綠原酸最大含量×0.30×100+各樣品中梔子苷含量/該組中梔子苷最大含量×0.2×100+各樣品醇浸出物/該組中最大醇浸出物×0.2×100。

表1說明水煎法大黃素、綠原酸、梔子苷損失量最大，提取量最少；乙醇回流法大黃素、綠原酸、梔子苷損失量最少，提取量最大。

2.4 醇取工藝條件的優選

由于乙醇回流法提取有效成分所得綜合評分最高，因而選擇乙醇回流法對提取工藝條件進行優選。影響乙醇回流法的因素有乙醇濃度、乙醇倍數、回流時間、提取次數等4個因素，提取次數根據單因素試驗結果確定提取次數為2次，其他每種因素選擇3個水平，按L9（34）正交表進行正交試驗，因素水平見表2、正交試驗結果見表3、方差分析見表4。

通過直觀分析，最佳工藝條件為A2B2C2，方差分析可知，用乙醇濃度對有效成分的含量具有顯著性的影響，故A因素選擇A2，考慮生產成本，B因素選擇B1，故確定A2B1C2為最佳提取工藝優選。該最佳工藝條件與正交試驗表中的第4號試驗條件相同，從而其合理性得到了試驗的驗證。

3 討 論

3.1 考察乙醇回流法提取次數采用的是單因素實驗法，結果顯示，提取2次與3次提取效果相差不大，綜合考慮，確定提取次數為2次。

3.2 預試驗時梔子苷的流動相[6]用乙腈-水（15∶85）分離度較好，但有稍許拖尾現象。將梔子苷流動相換成乙腈-0.1%硫酸（15∶85）分離度較好，拖尾現象消失。為了試驗方便，將梔子苷與綠原酸流動相合并，改為甲醇-0.1%硫酸（28∶72），結果符合分離度與拖尾因子的要求。

3.3 根據原劑型的使用習慣（用水調敷）以及藥物有效成分的性質，本實驗對水煎法、乙醇回流法、CO2超流界后藥渣用乙醇回流法三種方法進行比較，經多次試驗結果表明：乙醇回流法最佳。此實驗研究，對實現瘀腫消溫度敏感型原位凝膠提取的規范化、產業化有積極的指導意義。

[1]張兆旺.中藥藥劑學[M].中國中醫藥出版社,2004：83-93.

[2]韓建偉.《理瀹駢文》中關于中藥透皮吸收的理論和認識[J].湖北中醫雜志,2006,28(10)：14-15.

[3]Wang Y,Chen M,Ui X,et a1.A hybrid thermo-sensitive chitosan gel for sustained release of Meloxieam[J].J Biomater Sci Polrm Ed,2008,19(9)：1239-1247.

[4]杜廣增,趙浩如.Poloxamer 407溫敏性即型凝膠的制備和應用進展[J].藥學進展,2008,32(4)：163-167.

[5]馬廉正,肖學成.原位凝膠研究進展及質量控制要點[J].亞太傳統醫藥,2009,5(3)：141-142.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：化學工業出版社,2005：173.