結核分支桿菌兩種耐藥基因的快速檢測

李玉

近年來，全球結核病呈現死灰復燃的趨勢，其主要原因是耐藥(DR-TB)和耐多藥(MDR-TB)結核病的廣泛分布和迅速傳播。作為一線抗結核藥物，INH和RFP結核病的預防、治療方面起著重要作用。但由于單藥化療和不規則化療，其耐藥情況越來越嚴重。有研究表明結核分桿菌耐異煙肼的產生與過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關;而利福平耐藥則與RNA聚合酶的p亞基的編碼基因rpoB突變有關。我們在用PCR-SSCP方法單獨檢測KatG和rpoB基因突變時，發現在非變性聚丙烯酰胺凝膠中，這兩種基因的遷移率不同，且差異很大。因此，我們在一個反應中同時擴增KatG和rpoB基因。再根據其SSCP圖譜進行分析，這樣就可以同時檢測異煙肼和利福平耐藥性。我們采用PCRSSCP銀染法直接檢測臨床分離株和臨床痰標本中結核分支桿菌rpoB基因和KatG基因突變，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 107株臨床分離株和39例肺結核病患者涂陽痰標本均來自吉林市結核病防治研究所。107株臨床分離株按結核病診斷細菌學規程進行菌種鑒定及藥敏實驗證實為結核分支桿菌，其中63例耐RFP，55例耐INH，49例耐 SM。65例肺結核病患者涂陽痰標本根據臨床癥狀、涂片結果、胸部X線和培養結果確診，其中33例耐RFP，27例耐INH，28例耐SM。

1.2 引物序列為 rPOBl 5'CGGATGACCACCCAGGAC，rPOB2 5'GGTTTCGATCGGGCACAT，

KatGl 5'GCGATCACTACCGTGATCACA，

KatG2 5'GTCAGGGCGTCAAGTCGACTG

1.3 方法

1.3.1 dNA的提取 用傳統酚/氯仿抽提法提取標本中DNA。

1.3.2 PCR擴增 采用25 μl反應體系，4xdNTPs終濃度為0.2 mmol/L，引物終濃度為0.2 μmol/L，擴增程序為94℃變性1 min，61℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 1 min，循環 30 次，最后72℃延伸10 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測rPOB出現258bp條帶、KatG出現282bp條帶即為擴增陽性。

1.3.3 SSCP銀染 PCR擴增陽性的標本進行SSCP檢測，擴增產物加等量甲酰胺變性液95℃變性10 min，立即冰浴5 min，在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，條件為6℃/100V電壓，電泳約2～3 h，電泳結束后，取凝膠板經硝酸銀染色，觀察結果并照相。

2 結果

2.1 61株結核分支桿菌臨床分離株中，26株藥物敏感株中，各有1株KatG基因和rpoB基因發生突變。35株同時耐異煙肼和利福平分離株中，有22株有KatG基因突變，突變率62.9%。同時有31株有 rpoB基因發生突變，突變率為88.6%。結果見表1。

表1 異煙肼和利福平耐藥與KatG和rpoB基因突變結果

2.2 用PCR-SSCP技術分析對39例同時耐INH和耐RFP肺結核病患者的痰標本和24例非結核性肺部疾病組痰標本進行rpoB和KatG基因突變的檢測。以結核分支桿菌H37RV為對照，39例耐RFP痰標本中31例PCR擴增陽性，其中25例SSCP圖譜與H37Rv標準株有差異，rpoB突變率為64.1%。耐INH肺結核病患者的痰標本有28例擴增陽性，17例SSCP圖譜與H37Rv標準株有差異，突變率為43.5%。24例非結核病患者的痰標本rpoB基因和KatG基因PCR擴增均為陰性。

3 討論

目前，結核分支桿菌耐藥性測定仍多采用絕對濃度法、比例法等經典方法。但由于結核分支桿菌生長緩慢，而耐藥結核分支桿菌生長更為緩慢，其耐藥性測定需6～8周甚至更長，不能及時指導臨床用藥。近年來，隨著分子生物學的不斷發展已研究發現結核分支桿菌耐異煙肼的產生與過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關;而利福平耐藥則與RNA聚合酶的p亞基的編碼基因rpoB突變有關PCR-SSCP是一種檢測基因突變簡便、快速的方法。我們在一個反應中同時擴增KatG和rpoB基因。再根據其SSCP圖譜進行分析，這樣就可以同時檢測異煙肼和利福平耐藥性，結核分支桿菌臨床分離株rpoB基因和KatG基因突變，陽性率分別為88.6%、62.9%，表明結核分支桿菌異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG有關，KatG基因在INH耐藥中起主導作用。但有一部分耐INH株未檢測到KatG缺失或突變，提示某些菌株的耐INH形成可能與KatG無關。INH耐藥機制有待進一步研究。同時表明結核分支桿菌耐利福平與RNA聚合酶的p亞基的編碼基因rPOB有關，rPOB突變已成為結核分支桿菌耐RFP的主要遺傳指標。我們用此方法直接檢測結核病患者痰標本中結核分支桿菌rpoB基因和KatG基因突變，陽性率分別為64.1%、43.5%。rpoB基因和KatG基因突變低于臨床分離株。這可能與痰標本中雜DNA較多，rpoB為單拷貝，同時痰標本的處理和靶DNA濃度對PCR擴增也有直接影響。本文的結果表明，PCR-SSCP方法具有快速、簡便、敏感、特異性高的特點，可在2 d內出結果，并能直接用于臨床結核病患者痰標本結核分支桿菌耐藥性的檢測。從而彌補了常規藥敏實驗的不足，有望成為臨床耐藥性測定的重要手段之一。