MMP-9、TIMP-1和VEGF在兔頸動脈斑塊中的表達及其與新生血管的關系

趙華棟 范學軍 伍 明 樊建華 周 平 (中南大學湘雅三醫院神經內科，湖南 長沙 4003)

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組能降解細胞外基質的鋅依賴性蛋白酶，在動脈粥樣硬化形成及斑塊的不穩定性改變中，能起著主要的作用。目前基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)及基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)與頸動脈粥樣硬化斑塊特別是早期斑塊內新生血管的關系尚不肯定。本研究旨在通過檢測早期斑塊形成過程中MMP-9、TIMP-1及血管內皮生長因子(VEGF)表達水平，結合超聲造影檢查，以探討其在早期斑塊內新生血管形成中的作用及對斑塊穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康雄性新西蘭大白兔40只，由中南大學湘雅醫學院動物實驗中心提供，隨機分為4組，每組10只，空白對照組(A組)、高脂飲食組(B組)、硅橡膠圈干預聯合高脂飲食14及28 d組(C組、D組)，所有動物經適應性喂養1 w后用于實驗。

1.2 硅橡膠圈制作 參考劉恒方等〔1〕的方法，結合本實驗目的，硅橡膠圈采用液體醫用硅膠在模具(由中國機械工業第六研究設計院提供)中塑型為標準制作。

1.3 制作動脈粥樣硬化模型及取材 經耳緣靜脈緩慢注射3%的戊巴比妥鈉液 (30 mg/kg)，麻醉成功后，頸部正中切口，密閉型硅橡膠圈，置入右側頸動脈外膜。左側為偽手術組，接受相同操作，在縫合皮下前將硅橡膠圈取出。術后將牽拉的血管和神經放回原位置，硅橡膠圈開口處用硅膠封閉，避免硅膠和頸動脈的外膜接觸，術后75%酒精消毒切口處，肌注青霉素4萬U/次，2次/d，共計3 d。術后次日給予高脂飼料 (1%膽固醇+6%花生油+99%普通飼料)喂養，共喂養28 d。經超聲造影證實頸動脈斑塊模型制作成功后 (C組14 d超聲造影后，其余三組飼養28 d后)隨即過量麻醉處死動物，快速切除放置硅膠管處及對側相應的頸動脈組織，置入甲醛中固定，標本石蠟包埋，常規HE染色和Masson染色。

1.4 超聲造影 造模第14天、第28天行超聲以及超聲造影檢查。超聲下觀察兔左、右頸動脈斑塊形成情況。并以超聲下定位清楚的硅橡膠圈段頸動脈斑塊為超聲造影檢查對象，經耳緣靜脈快速團注SonoVue造影劑 (上海博萊科信宜藥業有限責任公司)，實時觀察并儲存造影全過程。對比觀察并收集各組有頸動脈斑塊的白兔的兩次數據。造影后通過彩色超聲診斷儀自帶的聲學定量分析軟件繪制頸動脈斑塊內和頸動脈管腔內的時間-強度曲線 (TIC)，測定其峰值強度 (PI)。

1.5 免疫組織化學檢測及結果判定 鼠抗兔MMP-9多克隆抗體、鼠抗兔TIMP-1多克隆抗體及兔抗人VEGF單克隆抗體均購自美國Thermo公司，CD31鼠單克隆抗體購自Abcam公司。石蠟包埋后標本行5 μm厚連續切片，一張行HE染色，一張行Masson染色，余者采用ABC法行免疫組化染色，染色步驟按說明進行。所有切片在尼康80i熒光顯微鏡下進行觀察并采集放大100倍及400倍時圖像，頸動脈斑塊內MMP-9、TIMP-1、CD31、VEGF陽性表達為細胞內棕褐色或棕黃色、淡黃色顆粒。圖像采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量斑塊內陽性細胞積分光密度 (IOD)值及面積并計算MOD值。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件，對資料進行t檢驗，兩變量間相關性分析采用線性相關分析。

2 結果

2.1 影像學觀察 頸動脈超聲A組、B組未見斑塊形成，第14天C組7只、D組10只兔硅橡膠圈段頸動脈管腔有不同程度狹窄，粥樣斑塊形成，超聲造影顯示斑塊內有新生血管形成，D組28 d超聲造影PI值明顯高于14 d(43.09±3.28，P＜0.05)，C、D組14 d的 PI值差異無顯著性 (24.37±1.58，23.72±2.09，P＞0.05)。

2.2 組織學觀察 C組、D組HE染色示兔右側硅橡膠圈段頸動脈管壁不光滑，管腔內有斑塊形成，內膜增厚，內膜下脂質浸潤，平滑肌細胞增生排列紊亂，斑塊內有CD31陽性表達標記的新生血管形成。A組和B組未見明顯斑塊形成。見圖1。

2.3 免疫組化分析

2.3.1 MMP-9、TIMP-1的表達 MMP-9、TIMP-1亦是胞質陽性表達，以細胞質內出現明顯的黃色或棕黃色顆粒視為陽性著色，在斑塊的肩部及巨噬細胞和泡沫細胞聚集區高表達，MMP-9、TIMP-1在A組、B組內膜無明顯陽性表達;在C組、D組斑塊有陽性表達，且隨斑塊的進展，MMP表達有所增高，TIMP-1表達減少，但均無統計學差異 (P＞0.05)。見表1，圖2。

2.3.2 VEGF的表達 VEGF蛋白是胞漿陽性表達，呈棕黃色，在斑塊內部及血管內膜均有著色，A組和B組家兔頸動脈動脈內膜基本上無血管內皮生長因子表達;C組與D組家兔頸動脈斑塊及血管內膜層染色血管內皮生長因子均有陽性表達，D組表達明顯多于C組 (t=8.546，P＜0.01)。見表1，圖 3。

2.3.3 CD31的表達 CD31標記的新生血管內皮細胞陽性染色呈棕黃色或棕褐色。A組、B組頸動脈內膜無CD31表達;C組、D組CAS斑塊內有CD31陽性表達標記的新生血管形成，且D組較C組新生血管明顯增多 (t=2.647，P＜0.05)。見表1，圖4。

2.3.4 相關性分析 在頸動脈早期斑塊組織中CD31的表達與MMP-9/TIMP、VEGF呈明顯正相關 (P＜0.01);CD31與MMP-9和TIMP-1表達均無明顯相關性 (P＞0.05)。

表1 C、D組MMP-9、MMP-9/TIMP-1、VEGF、TIMP-1及CD31蛋白表達水平比較(±s)

表1 C、D組MMP-9、MMP-9/TIMP-1、VEGF、TIMP-1及CD31蛋白表達水平比較(±s)

與C組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別MMP-9 MMP-9/TIMP-1 VEGF TIMP-1 CD31 C組(n=10) 0.391 5±0.127 1 0.598 6±0.110 2 0.224 4±0.031 40.633 7±0.076 1 0.275 5±0.035 8 D組(n=10) 0.420 6±0.236 2 0.894 3±0.291 3 0.316 4±0.046 51) 0.571 2±0.127 9 0.389 1±0.032 32)

圖1 各組動脈HE染色結果(×200)

圖2 頸動脈斑塊MMP-9、TIMP-1免疫組化結果(×200)

圖3 C、D兩組頸動脈斑塊VEGF免疫組化結果(×200)

圖4 C、D兩組頸動脈斑塊CD31免疫組化結果(×400)

3 討論

臨床研究表明，頸動脈粥樣硬化易損斑塊的形成和發展與斑塊內新生血管形成密切相關〔2〕。新生血管可以促進頸動脈粥樣硬化病變的發展，甚至誘發斑塊內出血和斑塊破裂，從而導致急性心腦血管疾病的發生。Moreno等〔3〕研究人類破裂的動脈粥樣硬化性斑塊中的新生血管數量，發現破裂斑塊內的微血管密度明顯高于未破裂斑塊，得出粥樣硬化斑塊內新生血管密度和斑塊不穩定性呈正相關的結論。

超聲造影是常規超聲檢查的有效補充，除具有可以清晰地顯示頸動脈血管壁內中膜(尤其是前壁)厚度，發現常規超聲易漏診的斑塊，較清晰顯示頸動脈遠端及深部病變，精確判斷頸動脈狹窄程度或閉塞等優勢外〔4～6〕，還可以實時追蹤并顯示斑塊內新生微小血管，根據增強情況對斑塊的易損性進行可視化定量評估。近年來國內外研究表明，超聲造影對頸動脈斑塊內新生血管的監測具有較高的敏感性，根據其增強情況對斑塊內新生血管的密度進行定量研究，從而評估斑塊的易損性。Shah等〔7〕對頸動脈內膜剝脫術的患者分別行斑塊超聲造影及病理組織學CD31、CD34免疫組化分析，證實了頸動脈斑塊內新生血管形成的造影增強超聲成像與手術標本的半定量組織學評分之間具有很好的相關性。

在斑塊新生血管形成過程中，MMPs起著重要作用，MMPs通過降解基底膜和重塑細胞外基質(ECM)使內皮細胞從原有血管遷移到外周形成新生血管〔8〕。MMP-9是MMP家族中重要的一員，可以降解Ⅳ型膠原和明膠，調節細胞間的黏附，客觀上有利于新生血管形成，TIMP-1是MMP-9的天然抑制劑，可與其1∶1結合而抑制其活性。研究表明，在腫瘤新生血管中，單純的MMPs升高并不一定導致新生血管形成，只有在MMPs與其抑制劑不平衡時才導致基質降解的不適當增加從而導致腫瘤組織新生血管形成增多〔9〕。本研究證實在頸動脈早期斑塊中新生血管形成與MMP-9/TIMP-1呈正相關，說明MMP/TIMP比例失調是導致頸動脈斑塊內新生血管形成的主要原因之一。

VEGF是促血管新生的重要因子，通過與血管內皮細胞的特異受體結合，發揮強大的促內皮細胞增殖、促血管生成作用〔10〕。研究表明，VEGF與MMPs具有相互促進作用。MMPs可以降解血管基膜及細胞外基質，調節細胞黏附，在新生血管形成中發揮重要作用;而VEGF則能特異性地促進內皮細胞增殖，提高血管通透性，促進細胞外基質降解;同時，TIMPs通過抑制MMPs的活性，抑制血管生成素誘導的血管內皮細胞出芽生長等，防止ECM降解，維持血管的穩定性，它們相互影響，共同參與斑塊內新生血管的發生、發展〔11〕。在本研究中，D組斑塊內VEGF表達較C組明顯增多，即隨著時間的延長斑塊內新生血管增多且與斑塊中MMP-9/TIMP-1呈正相關。

1 劉恒方，李新華，楊期東，等.改良硅橡膠圈加高膽固醇喂養誘導頸動脈狹窄兔模型的建立〔J〕.中國實用神經疾病雜志，2007;10(1):17-9.

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3 Moreno PR，Purushothaman KR，Sirol M，et al.Neovascularization in human atherosclerosis〔J〕.Circulation，2006;113(12):2245-52.

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7 Shah F，Balan P，Weinber M，et al.Contrast enhanced ultrasound imaging of atherosclerotic plaque neovascularization:a new surrogate marker of atherosclerosis〔J〕?Vasc Med，2007;12(2):291-7.

8 Joseph DR，Raouf AK.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease〔J〕.Biochem Pharmacol，2008;75(6):346-59.

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10 Hyder SM，Stancel GM.Regulation of angiogenic growth factors in the female reproductive tract by estrogens and progestins〔J〕.Mol Endol，1999;13(6):806-11.

11 夏玉芳，婁艷輝，于云鵬，等.MMP-2、TIMP-2及VEGF蛋白在子宮內膜異位癥裸鼠模型組織中的表達及意義〔J〕.青島大學醫學院學報，2007;4(13):313-5.