高水平維生素E對幼建鯉生長性能和消化吸收功能的影響

伍 曦 羅 輝 馮 琳,2,3 劉 揚,2,3 姜 俊,2,3 周小秋,2,3*

(1.四川農業大學動物營養研究所,雅安 625014；2.魚類營養與安全生產四川省重點高校實驗室,雅安 625014；3.動物抗病營養教育部重點實驗室,雅安 625014)

維生素E是魚類所必需的營養物質,缺乏維生素E會導致魚類出現生長緩慢、死亡率增加、血液紅細胞受損等缺乏癥[1-3]。已有的研究發現維生素E能促進普通鯉魚(Cyprinus carpio L.)[2]、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)[3]的生長,且有研究表明高于NRC推薦量的維生素E水平能顯著提高 斑 點叉 尾 鮰 (Ictaluruspunctatus Rafinesque)[4]、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[5]的生長性能。魚類生長與其消化吸收營養物質的能力有關[6],而消化器官的生長發育狀況影響魚類對營養物質的消化吸收[7]。此外,魚類腸道胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶等消化酶及堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶等刷狀緣酶涉及對營養物質的消化吸收[8-9],但目前僅見1篇關于維生素E能夠增加斑點叉尾鮰胃腸道蛋白酶以及脂肪酶活力的報道[4],而高水平維生素E對鯉魚等無胃魚類消化酶活力的影響以及對魚類消化器官生長發育和腸道刷狀緣酶活力的影響尚未見報道,因此開展相關研究很有必要。本試驗擬研究高水平維生素E對幼建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)生長性能的影響,并通過考察消化器官生長發育及消化吸收酶活力來研究高水平維生素E對幼建鯉消化吸收功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與試驗飼料

選用平均體重為(9.46±0.03)g的同一批次健康幼建鯉1 200尾,隨機分為8組,每組3個重復,每重復50尾魚,分別飼喂維生素E(DL-α-生育酚醋酸酯,純度為50%)添加水平為0(未添加對照 組)、100(NRC 推薦 量組)、750、1 000、1 250、1 500、1 750和 2 000 mg/kg的試驗飼料,試驗期60 d。試驗飼料以魚粉、大米蛋白粉為蛋白質源,其組成及營養水平見表1。飼料加工參考Lim等[5]的方法,并略作調整,原料經粉碎后過60目篩,混勻后加水經制料機制成條狀飼料,自然風干后經碎料機制成粒徑為1.5 mm左右的顆粒料,-20℃保存備用。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.2 飼養管理

魚苗購回馴化30 d后開始正式試驗,將魚苗飼養于循環流水過濾水族箱(90 cm×55 cm×30 cm)中,曝氣自來水為水源。試驗期平均水溫為(21.0±1.0)℃,pH 7.0左右,溶氧保持在5 mg/L以上。試驗期間根據幼建鯉攝食量、生長速度和水溫條件而調整投喂量,保證每次飼喂30 min后有剩料,迅速收集剩料用以計算攝食量。

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能

試驗開始和結束時對試驗魚稱重,計算增重。試驗期間記錄每天的攝食量,收集剩料并烘干稱重,試驗結束后計算攝食量和飼料系數。試驗前隨機選取與試驗魚體重一致的16尾魚用于魚體蛋白質、脂肪和灰分含量測定。試驗結束時,每重復隨機選取5尾魚,經冷凍干燥后分別用凱氏定氮法、索氏抽提法和高溫灼燒法測定魚體蛋白質、脂肪和灰分含量,并計算蛋白質、脂肪和灰分的沉積率。計算公式為:

式中,B為試驗結束時魚體中蛋白質(脂肪或灰分)總量(g)；A為試驗開始時魚體中蛋白質(脂肪或灰分)總量(g)；I為試驗期蛋白質(脂肪或灰分)攝入總量(g)。

1.3.2 肝胰臟和腸道重量及蛋白質含量

試驗最后1次投喂后12 h,每組選取體重接近的25尾魚,分離出肝胰臟與腸道,迅速稱重后經液氮速凍,-70℃保存備用。每組隨機選5尾魚的肝胰臟和腸道,用考馬斯亮藍法測定其蛋白質含量。

1.3.3 腸道皺襞高度

試驗最后1次投喂后12 h,從組1、2、5選取體重接近的4尾魚,分離前、中和后腸,分別固定于10%福爾馬林溶液中,按常規組織切片程序進行脫水 、石蠟 +包埋 、切片 (厚度 5 ～6 μm)和蘇木精-伊紅(HE)染色。用目視測微尺測定每段腸樣5個完整皺襞的高度,取其平均值作為該樣品皺襞高度的測定結果。

1.3.4 腸道消化酶和刷狀緣酶活力

每組從-70℃保存的樣品中隨機選5尾魚的腸道,于冰上解凍后迅速稱重,其后加入4℃生理鹽水,并在冰浴中用剪刀剪碎,再經超聲波細胞破碎儀制成組織勻漿,用于測定消化酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶)活力；每組隨機另選5尾魚的腸道用相同方法制備組織勻漿以測定刷狀緣酶(堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶)活力。胰蛋白酶和糜蛋白酶活力的測定分別采用N-苯甲酸精氨酸-對硝基苯胺 (BNPNA)法[11]和 Hummel法[12],脂肪酶活力的測定采用滴定法[11],堿性磷酸酶活力根據堿性磷酸酶在堿性溶液中的顏色反應測定,Na+,K+-ATP酶活力采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定。

1.4 數據分析

試驗結果采用平均值 ±標準差表示,用統計軟件SPSS 11.0對數據進行方差分析,結合Duncan氏法進行多重比較,檢驗各組之間差異顯著性,P＜0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 生長性能

維生素E對幼建鯉生長性能的影響見表2。末重、增重、攝食量、蛋白質沉積率、脂肪沉積率和灰分沉積率先隨維生素E含量增加而顯著增加(P＜0.05),在組 5(飼料中維生素 E含量1 257 mg/kg)達到最大值,其后隨維生素E含量繼續增加有所下降。飼料系數與增重有相反的變化趨勢。以增重為標識,根據二次曲線法確定幼建鯉飼料中維生素E最適水平為1 106 mg/kg(Y=-2.170 6×10-6X2+0.004 8X+7.378 4,R2=0.911,P ＜0.01)。

2.2 消化器官生長發育

維生素E對幼建鯉消化器官生長發育的影響見表3。肝胰臟和腸道重量隨維生素E含量增加而顯著增加(P＜0.05),在組5達到最大值,其后隨維生素E含量繼續增加有所下降；肝胰臟和腸道蛋白質含量也有近似的變化趨勢,且均在組5達到最大值。

2.3 腸道皺襞高度

維生素E對幼建鯉腸道皺襞高度的影響見表4。組5前、中和后腸皺襞高度顯著高于組1(飼料維生素E含量7 mg/kg)(P＜0.05),且前和后腸皺襞高度顯著高于組2(飼料維生素 E含量107 mg/kg)(P＜0.05)；組2前和后腸皺襞高度顯著高于組1(P ＜0.05)。

表2 維生素E對幼建鯉生長性能的影響Table 2 Effects of dietary vitamin E on growth performance of juvenile Jian carp

表3 維生素E對幼建鯉肝胰臟重量、肝胰臟蛋白質含量、腸道重量和腸道蛋白質含量的影響Table 3 Effects of dietary vitamin E on hepatopancreas weight,heptopancreas protein content,intestine weight and intestine protein content of juvenile Jian carp

表4 維生素E對幼建鯉前、中和后腸皺襞高度的影響Table 4 Effects of dietary vitamin E on folds height in foregut,midgut and hindgut of juvenile Jian carp μm

2.4 腸道消化酶和刷狀緣酶活力

由表5可見,維生素E對幼建鯉腸道消化酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶)活力有顯著影響(P＜0.05)。腸道胰蛋白酶活力隨維生素E含量增加而顯著增加(P＜0.05),在組5達到最大值,其后隨維生素E含量繼續增加有所下降；腸道糜蛋白酶和脂肪酶活力也有近似的變化趨勢,且均在組5達到最大值。

表5 維生素E對幼建鯉腸道消化酶活力的影響Table 5 Effects of dietary vitamin E on the digestive enzyme activities in intestinal tract of juvenile Jian carp U/g

由表6可見,維生素E對幼建鯉腸道刷狀緣酶(堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶)活力有顯著影響(P＜0.05)。堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶活力均隨維生素E含量增加而顯著增加(P＜0.05),在組5達到最大值,其后隨維生素E含量繼續增加有所下降。

表6 維生素E對幼建鯉腸道刷狀緣酶活力的影響Table 6 Effects of dietary vitamin E on the brush border enzyme activities in intestinal tract of juvenile Jian carp U/g

3 討 論

3.1 高水平維生素E對幼建鯉生長性能的影響

維生素E是水生動物必需的營養素,飼料中適宜水平的維生素E可提高條石鯛[3]、斑點叉尾鮰[4]等的生長性能。本研究發現,當維生素E含量達到1 257 mg/kg時幼建鯉增重最大,且比NRC推薦量組(飼料維生素E含量107 mg/kg)提高32.62%。這說明適宜高水平維生素E能促進魚類的生長。然而,本試驗的增重整體偏低,其原因可能與水溫有關。本試驗平均水溫在21℃左右,建鯉適宜生長水溫在26℃左右,水溫過低會降低魚的增重。本實驗室研究幼建鯉對泛酸[13]、硫胺素[14]的需求時水溫高于本試驗3～4℃,相應地其相近初始體重的幼建鯉在飼養相近時間后增重高于本試驗。攝食量及飼料系數會影響魚類生長。本研究結果發現,維生素 E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,攝食量提高13.75%。在斑點叉尾鮰上的研究也發現維生素E對攝食量有提高的作用[4]。此外,當飼料維生素E含量達到1 257 mg/kg時,飼料系數最小。而前人的研究也表明,維生素E能夠顯著降低南亞野鯪(Labeo rohita)的飼料系數[15],提高印度鯪(Cirrhinus mrigala)的飼料效率[16]。進一步分析表明,增重與攝食量和飼料系數之間均呈極顯著正相關關系 (r=0.995 0,P ＜0.01；r=0.993 0,P ＜0.01),說明高水平維生素E可通過提高攝食量和降低飼料系數來促進幼建鯉生長。魚類的增重主要是由體蛋白質、體脂肪和體灰分沉積引起[17]。本研究表明,飼料維生素E含量達到1 257 mg/kg時,與NRC推薦量組相比,魚體蛋白質、脂肪和灰分沉積率分別提高39.68%、15.30%和46.35%,說明適宜高水平維生素E能增加機體蛋白質、脂肪和灰分的沉積。

普通鯉魚缺乏維生素E會引起生長受阻、骨骼肌變性壞死等缺乏癥[2,18]。目前,普通鯉魚等魚類確定的維生素E需要量大多指不出現缺乏癥的最低需要量[1-2],也有少量采用最佳生長時的用量[3],但其設計水平是以最低需要量為基礎適當放寬的結果。有研究表明,高于最低需要量數倍的維生素E對魚類具有促進生長及提高免疫的作用[5],因此以不出現缺乏癥為標準確定的需要量并不能滿足最佳生長的需要。因此,本研究以幼建鯉最佳生長為判斷依據確定了維生素E的適宜水平為1 106 mg/kg,高于最低需要量10倍左右。該結果與Lim等[5]在尼羅羅非魚上的研究結果一致。然而,當維生素 E含量超過1 257 mg/kg以后,幼建鯉攝食量、增重開始下降,說明過高水平維生素E對魚類生長不利。這與Takeuchi等[19]在草魚上的發現一致。維生素E過量引起生長性能下降的原因可能與維生素E過量造成其他脂溶性維生素(如維生素 D和維生素K)的缺乏有關[20]。

3.2 高水平維生素E對幼建鯉消化器官生長發育的影響

魚類胰腺與腸道的生長發育狀況會影響消化吸收酶的分泌量與活力[6]。目前未見維生素E影響魚類消化器官生長發育的研究報道。本研究表明,維生素E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,肝胰臟重量和蛋白質含量分別提高24.95%和25.15%。這說明適宜高水平維生素E可以促進魚類肝胰臟的生長發育。腸道在魚類對營養物質的消化吸收上起著重要的作用,腸道的生長發育狀況與其消化吸收功能密切相關[21]。腸道重量和蛋白質含量通常可以用來反映腸道的生長發育狀況。本研究發現,當維生素E含量達到1 257 mg/kg時,幼建鯉的腸道重量和蛋白質含量達到最大,且比NRC推薦量組分別提高20.41%和28.24%。可見,適宜高水平維生素E可以促進魚類消化器官的生長發育。

3.3 高水平維生素E對幼建鯉消化吸收能力的影響

消化酶在魚類對營養物質的消化中發揮著重要作用[9]。魚類消化酶主要由胰腺分泌后進入腸道發揮消化作用,因此腸道消化酶活力可以反映魚類的消化能力[8]。維生素 E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,腸道胰蛋白酶、糜蛋白酶和脂肪酶活力分別提高38.96%、32.61%和9.57%。這說明適宜高水平維生素E可以提高魚類消化能力。何敏等[4]在斑點叉尾鮰上的研究也發現維生素E能夠增加斑點叉尾鮰胃腸道蛋白酶以及脂肪酶活力,本試驗結果與其一致。

腸道是魚類吸收營養物質的主要場所[9],腸道皺襞高度可反映魚類腸道吸收面積,因此其可作為水生動物腸道吸收能力的重要標識[22]。目前未見維生素E影響魚類腸道皺襞高度的研究報道,但研究發現泛酸[13]和硫胺素[14]能顯著增加建鯉的腸道皺襞高度。本研究發現,維生素E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,幼建鯉前、中和后腸皺襞高度分別提高10.85%、7.48%和6.24%。這說明適宜高水平維生素E可以通過提高腸道皺襞高度來提高魚類腸道的吸收能力。

魚類腸道刷狀緣酶如堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶等參與了營養物質的吸收[9]。堿性磷酸酶與脂類、礦物質等營養物質的吸收有關,其活力被認為是魚類對營養物質吸收強度的標識[23]；而Na+,K+-ATP酶活力可反映小腸黏膜對氨基酸的吸收能力[24]。目前未見維生素E影響魚類腸道刷狀緣酶活力的研究,但Wen等[13]和 Huang等[14]的研究分別發現泛酸和硫胺素能顯著增加建鯉的堿性磷酸酶及Na+,K+-ATP酶活力。本試驗發現,維生素E含量為1 257 mg/kg組與NRC推薦量組相比,腸道堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶活力分別提高26.06%和35.48%,說明適宜高水平維生素E增強了魚類腸道的吸收能力。

4 結 論

①適宜高水平維生素E能促進幼建鯉生長,其促生長作用與提高攝食量和降低飼料系數有關。

②適宜高水平維生素E提高了幼建鯉消化吸收能力,消化能力的提高與其促進消化器官生長發育,提高蛋白酶、脂肪酶活力有關；吸收能力的提高與腸道皺襞高度和刷狀緣酶(堿性磷酸酶、Na+,K+-ATP酶)活力的增加有關。

③以增重為標識,根據二次曲線法確定幼建鯉飼料中維生素E最適水平為1 106 mg/kg。

[1] POSTON H A,COMBS G F,LEIBOVITZ L.Vitamin E and selenium interrelations in the Atlantic salmon:gross,histological,and biochemical deficiency signs[J].Journal of Nutrition,1976,106:892-904.

[2] WATANABE T,HIBIYA T.Effects of α-tocopherol deficiency on carp[J].Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries,1970,36:623-630.

[3] GALAZ G B,KIM S S,LEE K J.Effects of different dietary vitamin E levels on growth performance,non-specific immune responses,and disease resistance against Vibrio anguillarum in Parrot fish(Oplegnathus fasciatus)[J].Asian-Australasian Journal of Animal Science,2010,23(7):916-923.

[4] 何敏,汪開毓,張宇,等.維生素E對斑點叉尾魚回生長性能和消化酶活性的影響[J].水產學報,2009,33(2):288-294.

[5] LIM C,YILDIRIM-AKSOY M,LI M H,et al.Influence of dietary levels of lipid and vitamin E on growth and resistance of Nile tilapia to Streptococcus iniae challenge[J].Aquaculture,2009,298:76-82.

[6] HAKIM Y,UNI Z,HULATA G,et al.Relationship between intestinal brush border enzymatic activity and growth rate in tilapias fed diets containing 30%or 48%protein[J].Aquaculture,2006,257:420-428.

[7] GARC ìA-GASCA A,GALAVIZ M A,GUTIé RREZ J N,et al.Development of the digestive tract,trypsin activity and gene expression in eggs and larvae of the bullseye puffer fish Sphoeroides annulatus[J].Aquaculture,2006,251:366-376.

[8] CAHU C,R?NNESTAD I,GRANGIER V,et al.Expression and activities of pancreatic enzymes in developing sea bass larvae(Dicentrarchus labrax)in relation to intact and hydrolyzed dietary protein involvement of cholecystokinin[J]. Aquaculture,2004,238:295-308.

[9] SILVA F C P,NICOLI J R,ZAMBONINO-INFANTE J L,et al.Influence of partial substitution of dietary fish meal on the activity of digestive enzymes in the intestinal brush border membrane of gilthead sea bream,Sparus aurata and goldfish,Carassius auratus[J].Aquaculture,2010,306:233-237.

[10] NRC.Nutrient requirements of fish[S].Washington,D.C.:National Academy Press,1993.

[11] 桂遠明.水產動物機能學實驗[M].北京:中國農業出版社,2004:116-119.

[12] 施特爾馬赫.酶的測定方法[M].北京:中國輕工業出版社,1992:123-125.

[13] WEN Z P,ZHOU X Q,FENG L,et al.Effect of dietary pantothenic acid supplement on growth,body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)[J].Aquaculture Nutrition,2009,15:470-476.

[14] HUANG H H,FENG L,LIU Y,et al.Effects of dietary thiamin supplement on growth,body composition and intestinal enzyme activities of juvenile Jian carp(Cyprinus carpio var.Jian)[J].Aquaculture Nutrition,2010,published online,doi:10.1111/j.1365-2095.2010.00756.x.

[15] SAU S K,PAUL B N,MOHANTA K N,et al.Dietary vitamin E requirement,fish performance and carcass composition of rohu(Labeo rohita)fry[J].Aquaculture,2004,240:359-368.

[16] PAUL B N,SARKAR S,MOHANTY S N.Dietary vitamin E requirement of mrigal,Cirrhinus mrigala fry[J].Aquaculture,2004,242:529-536.

[17] R?NNESTAD I,TONHEIM S K,FYHN H J,et al.The supply of amino acids during early feeding stages of marine fish larvae:a review of recent findings[J].Aquacultrue,2003,227:147-164.

[18] 耿毅,汪開毓,周震.維生素E缺乏對鯉骨骼肌損傷的影響[J].動物營養學報,2006,18(4):267-271.

[19] TAKEUCHI T,WATANABE K,SATO H,et al.Requirement of grass carp fingerling for α-tocopherol[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1992,58(9):1743-1749.

[20] 周筱丹,董曉芳,佟建明.維生素E的生物學功能和安全性評價研究進展[J].動物營養學報,2010,22(4):817-822.

[21] EL-BAKARY N E R,EL-GAMMAL H L.Comparativehistological,histochemical and ultrastructrural studies on the proximal intestine of flathead grey mullet(Mugil cephalus)and sea bream(Sparus aurata)[J].World Applied Sciences Journal,2010,8:477-485.

[22] OLLI J J,KROGDAHL A.Nutritive value of four soybean products as protein sources in diets for rainbow trout(Oncorhynchus mykiss,Walbaum)reared in fresh water[J].Acta Agriculturae Scandinavica Section A:Animal Science,1994,44(3):185-192.

[23] TENGJAROENKUL B,SMITH B J,CACECI T,et al.Distribution of intestinal enzyme activities along the intestinal tract of cultured Nile tilapia,Oreochromis niloticus L.[J].Aquaculture,2000,182:317-327.

[24] VEILLETTE P A,GRAHAM Y.Temporal changes in intestinal Na+,K+-ATPase activity and in vitro responsiveness to cortisol in juvenile chinook salmon[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular＆Integrative Physiology,2004,138(3):297-303.