利用家蠶BmNPV生物反應器規模化生產基因工程產品的關鍵技術研究

丁 農 張金衛 李江濤 魚南洋 鄒國平 馮世民 徐森華

(1湖州市農業科學研究院，浙江湖州 313000; 2長興縣農業局，浙江長興 313100)

隨著現代生物技術的發展，家蠶生物反應器(即家蠶－BmNPV表達系統)成為免疫學和基因工程真核生物表達系統等研究領域的重大進展之一［1］。家蠶生物反應器被認為是目前最有經濟意義的個體表達系統，有基因工程產品“微型發酵罐”之稱，在免疫學的研究和應用中成為制備新型基因工程疫苗的優選體系。在人以及動物的傳染病中，已有乙肝、丙肝、禽馬立克氏病、傳染性法氏囊病及口蹄疫(FMDV)等多種病毒的相關保護性抗原基因，在家蠶－BmNPV表達系統中得到成功表達［2－8］，重組基因工程疫苗的研制成功，在醫學和農業科研中發揮了重要的作用，展示出誘人的應用前景。

目前，應用家蠶生物反應器生產基因工程產品，主要是利用注射器對蠶蛹蛹體逐一進行人工接種，在操作過程中存在以下問題:一是蠶蛹蛹期短，很難進行規模化生產;二是用工量大、時間集中，勞動強度大、生產效率低;三是接種量很難控制，誤差大，造成蛹體接種后反應不一致，既影響產品的質量，又增加后續工作量。本研究是在中國農業科學院生物技術研究所和中國農業科學院蘭州獸醫研究所研制口蹄疫基因工程疫苗的基礎上，利用家蠶生物反應器進行口蹄疫疫苗抗原規模化生產關鍵技術的研究，為家蠶生物反應器進行規模化生產提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養液，由中國農業科學院生物技術研究所提供;口蹄疫ELISA檢測試劑盒，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供;秋豐×白玉蠶品種，由湖州市農業科學研究院提供。

1.2 蠶蛹最佳冷藏時間試驗

將秋豐×白玉飼養至上蔟7 d后采繭并冷藏于4～5℃中保存，每隔5 d取1批蠶繭(200粒)削繭后取出蠶蛹，按每顆蛹105pfu的劑量接種rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養液，然后放置在25℃環境下表達4～5 d，收集發病蠶蛹血淋巴，于－20℃保存，共接種4批，以接種未經冷藏的蠶蛹作為對照。根據口蹄疫ELISA檢測試劑盒操作步驟，檢測口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在不同冷藏時間蠶蛹中的表達效率。具體操作步驟:96孔酶標板用兔抗FMDV陽性血清包被，4℃過夜;用脫脂奶粉封閉后，將所收集的蠶蛹血淋巴做2倍梯度稀釋，37℃作用1 h;用PBS洗滌后加入豚鼠抗FMDV陽性血清，37℃作用1 h;用PBS洗滌后加入HRP－兔抗豚鼠IgG，37℃作用1 h;加入底物OPD－H2O2，于37℃作用15 min，用終止液結束反應，于492 nm處測定A值，即OD492nm值，該值越大表明表達的外源蛋白量越大。

1.3 目的蛋白在規模化生產中的表達時相的測定

將秋豐×白玉飼養至上蔟7 d后采繭、削繭，取100 kg蠶蛹接種rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養液，接種后從48 h開始，每隔12 h收集發病蠶蛹，用口蹄疫ELISA檢測試劑盒測定口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在蠶蛹中的表達時相。

1.4 蠶蛹集團注射機的研制及與手工注射的比較試驗

在利用家蠶生物反應器生產基因工程產品的過程中，對蠶蛹蛹體的接種一般都是由人工逐一進行接種的，但是由于接種人員的熟練程度、疲勞程度等原因易導致接種量很難控制，人為誤差較大，并且用工比較集中。為了解決這一問題，我們根據蠶蛹接種的一系列步驟(注射器消毒、清洗、加液、接種)與特點，試制了家蠶蠶蛹集團注射機。并檢驗了蠶蛹集團注射機的生產效率，方法是取100 kg蠶蛹接種rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養液，用蠶蛹集團注射機和人工分別接種50 kg蠶蛹，從注射量精確度、注射速度、注射后蠶蛹的死亡率及目的蛋白的表達量進行比較。

2 結果與分析

2.1 蠶蛹最佳冷藏時間試驗

利用口蹄疫ELISA檢測試劑盒檢測口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在不同冷藏時間蠶蛹中的表達效率，結果顯示將蠶蛹冷藏于4℃后，5 d與10 d時的基因表達效率與未經冷藏處理蠶蛹的表達效率非常接近，能夠滿足規模化生產的需求;而15、20 d時的表達效率雖然也相近，但卻遠低于未經冷藏處理蠶蛹的表達效率，不能滿足規模化生產的要求(表1)。從本次試驗結果可知，將蠶蛹保藏于4℃10 d內接種不會影響目的蛋白在蠶蛹中的表達效率，在規模化生產中可以利用冷藏來延長蠶蛹的接種期限，加大產品的生產量。

表1 口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在不同冷藏時間蠶蛹中的表達效率(OD492 nm)

2.2 目的蛋白在規模化生產中的表達時相的測定

為了確定目的蛋白的最佳收集時間，對蠶蛹接種rBmNPV(P1－2A3C)重組病毒培養液后，從48 h開始，每隔12 h隨機收集200頭發病蠶蛹的血淋巴，于－20℃下保存。利用口蹄疫ELISA檢測試劑盒檢測血淋巴中目的蛋白的表達量，結果是在48 h時就檢測到了目的蛋白的表達，且隨著感染時間的延長而迅速增加，108 h后保持穩定狀態。因此，在蠶蛹接種后108～120 h收集蠶蛹的血淋巴，均可獲得很高的蛋白表達量。從而可知，蠶蛹在108 h時目的蛋白的表達量達到最高量并保持穩定狀態(表2)。

表2 口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在蠶蛹中不同時間的表達效率

2.3 蠶蛹集團注射機的研制及與手工注射的比較試驗

根據家蠶蠶蛹接種的一系列步驟特點，我們研制了家蠶蠶蛹集團注射機(圖1)，該機器是一種半自動化的機械注射裝置，具有高效、安全、注射量準確、結構簡單及使用方便的特點。該機器已獲國家發明和實用新型專利(專利號分別為:ZL 2009 1 0095597.1、ZL 2009 2 0113230.3)。

圖1 蠶蛹集團注射機整體結構示意圖

家蠶蠶蛹集團注射機研制成功后，我們進行了用蠶蛹集團注射機注射蠶蛹與手工注射蠶蛹的比較試驗，從試驗結果看(表3)，機器注射的工作效率是手工注射的4.26倍，注射后蠶蛹的死亡率、目的蛋白的表達量相近。值得注意的是，手工注射的速度與操作人員的熟練度、疲勞度等因素有關。由于機器注射和手工注射使用的是同一型號的注射器，故精確度是一樣的，但在實際操作中，人工注射由于不同操作人員的熟練度不一樣而導致注入蠶蛹的病毒量會出現誤差，而機器注射則避免了這一誤差。

表3 蠶蛹集團注射機注射蠶蛹與手工注射蠶蛹的效果比較

3 小結與討論

家蠶飼養歷史悠久，遺傳背景清楚，利用家蠶生物反應器生產有用蛋白比其他表達系統更具優勢。目前，已有多種蛋白得到了高效表達，部分蛋白生產已取得了轉基因生物安全生產證書，可以進行大規模的面上生產。在家蠶生物反應器生產的目的蛋白中，多數是利用家蠶幼蟲進行表達目的蛋白，雖然家蠶幼蟲能獲得高效的目的蛋白表達，但由于幼蟲期比較活潑，逐一接種難度比較大，且收獲目的蛋白時較為麻煩。我們研究發現利用家蠶蠶蛹進行目的蛋白表達可以獲得同樣的效果，并且更容易收獲目的蛋白，這為規模化利用家蠶生物反應器生產有用蛋白奠定了基礎。

本研究主要是在中國農業科學院生物技術研究所和中國農業科學院蘭州獸醫研究所研制的口蹄疫基因工程疫苗的基礎上，研究利用蠶蛹進行規模化生產的關鍵技術，根據口蹄疫抗原組合基因(P1－2A3C)在不同冷藏時間的蠶蛹中的表達效率可知，通過低溫(4℃)冷藏蠶蛹，可以延長10 d的生產時間，并且其蛋白的表達效率幾乎不受影響，從而可以加大產品的生產量。值得注意的是，在應用蠶蛹進行生產其他基因工程產品時，隨著表達的目的蛋白的不同，蠶蛹的冷藏時間會有所不同，實際生產中應根據表達不同的目的蛋白進行蠶蛹冷藏時間實驗，確定所要生產蛋白的蠶蛹的最佳冷藏時間。

在生產中所表達的目的蛋白的收獲時間是非常重要的，收獲時間過早很難獲得高效表達，收獲時間過晚會影響蛋白的穩定性，從目的蛋白在規模化生產中的表達時相來看，在規模化生產中，蠶蛹接種后108～120 h收集蠶蛹的血淋巴，可獲得最高的蛋白表達量。

在生產中需要對蠶蛹逐一接種，這在一定程度上阻礙了目的蛋白的生產，本研究中所發明的蠶蛹集團注射機很好地解決了這一問題，該機器使注射器的消毒、清洗、加藥、蠶蛹接種在機械上逐一完成，明顯提高了產品質量，工作效率是手工注射的4～5倍，注射后蠶蛹的死亡率和目的蛋白的表達量與手工注射相近，減輕了勞動強度，降低了生產成本，并且其結構簡單、使用方便，便于利用蠶蛹作為生物反應器大規模生產基因工程產品。

［1］張耀洲，吳祥甫.家蠶生物反應器［M］.杭州:浙江大學出版社，2008.

［2］楊瑞麗，任學毅，趙秀玲，等.家蠶蛹表達乙肝表面抗原中蛋白免疫原性的研究［J］.農業生物技術學報，2002，10(4):359－362.

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